Nguyên lý: Mồi và mẫu dò được thiết kế dựa vào vùng 5’NC, tại vùng này có thể phẩn biệt được các genotype dựa vào sự khác nhau của trình tự nucleotide.
Cách thực hiện: thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan. Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần dùng, cất PCR mix lại ngay rồi mới thực hiện các bước tiếp theo. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm nhẹ tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube. Viết ký hiệu và đánh số mẫu lên thành tube vì thiết bị đọc real-time từ nắp của tube.
Thực hiện phản ứng: Cho 2,5 µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào từng tube iVAHCV Genotype 1-6 rPCR Mix và iVAHCV Genotype 2-3 rPCR Mix (mỗi mẫu, kể cả chứng +/- đều phải cho vào cả 2 tube). Phải kiểm tra chắc chắn phần dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm nhẹ và đặt các tube vào máy real-time PCR.
Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc realtime ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real-time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy tính đã kết nối với nhau. Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 105 0C thì chương trình luân nhiệt bắt đầu. Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã được đặt trên máy real-time PCR.
Với mẫu: chọn mẫu là “Unknown”. Đặt tên hoặc số tương ứng với ký hiệu của mẫu. Mỗi mẫu có 2 tube tương ứng, đặt tên “Ký hiệu mẫu-1.6” ứng với tube Genotype 1-6, “Ký hiệu mẫu-2.3” ứng với Genotype 2-3.
Với chứng dương và chứng âm: để kiểm tra, nên chọn loại mẫu là “Unknown”. Đặt tên và số ký hiệu tương ứng với mẫu. Không nên chọn “PTC – Possitive control” và “NTC – Negative control”. Đặt tên “Chứng dương”, “Chứng âm” tương ứng.
Chọn màu “FAM” và “HEX” cho tất cả các mẫu, chứng dương và chứng âm.
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt định genotype cài đặt cho máy real-time PCR.
Nhiệt độ Thời gian Số chy kỳ
95 0C 5 phút 1 chu kỳ
95 0C 15 giây
40 chu kỳ
65 0C 1 phút
(Đọc kết quả tại bước này)
Quy trình thực hiện chạy real-time HCV sử dụng kít LightPoweriVAHCV Genotype RT-rPCR kít có thể được giải thích như sau: 95 0C trong 5 phút giúp cho enzyme Taq polymerase bắt đầu thoát khỏi lớp áo protein (hotstart, Phạm Hùng Vân, 2008), trong gia đoạn này Taq polymerase bắt đầu hoạt động, kết thúc giai đoạn hotstart, chu kỳ luân nhiệt bắt đầu. Chu trình nhiệt cho 40 chu kỳ: 95 0C trong 15 giây, biến tính DNA, cắt đứt các liên kết hydro, các DNA biến thành mạch đơn, enzyme bắt đầu hoạt động. 65 0C trong 1 phút giúp cho Taq polymerase hoạt động hiệu quả ngoài ra probe bắt cặp vào trình tự đích, primer bắt đầu bắt cặp vào trình tự đích sau khi probe bắt cặp. đây cũng là khoảng nhiệt độ và thời gian kéo dài của chuỗi DNA đích khi primer bắt cặp đặc hiệu. Khi quá trình kéo dài bắt đầu thì đầu Q (quencher của probe) sẽ bị cắt đứt và sẽ phát tính hiệu huỳnh quang, mắt đọc huỳnh quang của máy real-time sẽ bắt và mã hóa huỳnh quang nhận được.
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN