3.3.1. Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang. Thu thập số liệu: tiến cứu.
Sử dụng kỹ thuật real-time RT-PCR để định lượng và định genotype HCV, phát hiện HCV trên mẫu bệnh phẩm và khảo sát tình hình nhiễm HCV tại bệnh viện 175.
3.3.2. Kỹ thuật nghiên cứu
Phương pháp chuẩn đoán Real- time PCR – công nghệ Photomutiplier Tube sử dụng Taqman probe. Probe được đánh dấu màu FAM để phát hiện tác nhân gây bệnh.Probe được đánh dấu màu HEX để phát hiện chứng nội tại. Các bước trong xét nghiệm định lượng real- time PCR phát hiện HCV trình bày trong hình 3.1.
Hình 3.1 Quy trình Real – time PCR. (Phạm Hùng Vân, 2009).
3.3.3. Lấy máu và ly trích huyết thanh
Thu thập bệnh phẩm: máu (3 ml) Lấy 1-3 ml máu tĩnh mạch, cho vào ống nghiệm vô trùng. Ghi rõ tên bệnh nhân, khoa, ngày lấy.
Máu toàn phần (khoảng 3 ml) được ly tâm bằng máy ly tâm thường 13.000 vòng/phút trong 20 phút, tách huyết thanh và bảo quản -35 0C cho tới khi sử dụng.
Khi sử dụng cho huyết thanh đã ly tâm vào các ống eppendoff đã được đánh số tương ứng với từng bệnh nhân.
3.3.4. Phương pháp tách chiết RNA
Nguyên tắc: Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
RNA là các phân tử mạch đơn kém bền, khi tách chiết cần lưu ý tránh mọi tác nhân cơ học hay hóa học qía mạnh có thể làm đút gãy chúng.
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý, hóa học hoặc kết hợp nhiều tác nhân, giải phóng RNA ra môi trường.
Bước 2: Kết hợp chloroform và phenol loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid, polysaccharide và lượng phenol ở bước 1). Sau đó đem ly tâm, protein biến tính sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol- chloroform, thu nhận lại pha trước chứa nucleic acid.
Bước 3: Tủa nucleic acid. Thường dùng ethanol thể tích 2,5:1 trong môi trường lực ion cao (nồng độ muối cao) hoặc dùng isopropanol thể tích 1:1. Cặn nucleic thu được bằng ly tâm được hòa trong nước cất 2 lần đã xử lý với DEPC để bảo quản. Quy trình tách chiết RNA được tiến hành như sau:
Đánh dấu các tube 1,5ml biopure bằng kí hiệu mẫu.
Cho 200µl mẫu vào 1tube biopure có sẵn 900µl dung dịch pER1, vortex 30s, để yên trong 10 phút.
Thêm 200µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube phải chuyển sang màu trắng đục. Để yên 10 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Thu 600µl dịch nổi có chứa RNA vào 1 tube biopure có sẵn 600µl dung dịch pEX3. Trộn đều, để yên trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng. Cho từ từ 900µl dung dịch EX4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60 0C trong 10 – 15 phút. Cho vào 50µl dung dịch ER5. Trước khi sử dụng dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan hoàn toàn. Bảo quản mẫu ở -20 0C. Lưu trữ mẫu lâu phải bảo quản ở -70 0C với RNase inhibitor.
3.3.5. Phương pháp real-time RT-PCR
Phương pháp real-time RT-PCR hai bước sử dụng cho định lượng và định genotype được tiến hành bước đầu là chạy RT tạo cDNA từ RNA-HCV và sau đó tiến hành phương pháp real-time PCR.
3.3.5.1. Phương pháp RT
Cách thực hiện như sau: cho 15 µl dịch RNA tách chiết vào eppendorf RT mix (do công ty Việt Á sản xuất), đậy nắp eppendorf thật kỹ, ly tâm nhẹ và đặt vào máy RT.
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt chạy cDNA cài đặt cho máy real-time PCR
25 0C 5 phút
1 chu kỳ
42 0C 30 phút
85 0C 5 phút
Giữ ở 4 0C cho tới khi sử dụng.
Phương pháp Chạy cDNA sử dụng mồi ngẫu nhiên của công ty Việt Á qua các chu kỳ luân nhiệt 25 0C trong 5 phút để mồi ngẫu nhiên bắt cặp vào RNA đích, rồi 42 0C trong 30 phút để enzyme reverse transcriptase tổng hợp cDNA đồng thời RNAse H cắt bỏ RNA đích ra khỏi cDNA, cuối cùng ủ 85 0C trong 5 phút để phá hủy enzyme reverse transcriptase và enzyme RNAse H sau khi chúng đã hoàn tất nhiệm vụ.
3.3.5.2. Phương pháp real-time PCR định lượng HCV
Nguyên lý: định lượng nồng độ RNA-HCV phải dựa vào đường chuẩn được xây dựng với bộ kít iVAqPCR 3Standard Kít do công ty Việt Á sản xuất sử dụng 3 nồng độ định lượng là 102, 104, 106.
Phân tích đường biểu diễn chuẩn: Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn. Có hai thông số được máy tính toán và hiển thị trên một đường biểu diển chuẩn. Hai thông số này rất có giá trị để người làm thử nghiệm có thể đánh giá được thao tác pipetting của mình trong quá trình thử nghiệm.
Thông số về Hệ số tương quan R2 đánh giá độ chính xác của thao tác pipetting lấy có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R2 phải đạt là trên hay bằng 0.99 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn đạt tuyến tính cao. Khi người làm thử nghiệm không lấy được thể tích chính xác thì chắc chắn các thể tích mẫu chuẩn cho vào real–time PCR mix sẽ không thể nào chính xác được nên R2 sẽ không thể nào đạt được >= 0.99
Thông số về Hiệu quả PCR là E ( PCR efficiency) hiệu quả phản ứng sẽ cho biết các thông tin có giá trị về hóa chất phản ứng.
E% = (10-1/slope – 1) x 100% Chấp nhận : 90 105%
E% < 90% : Mồi không nhạy, pha loãng mẫu bị thiếu E% >105% : Mồi không đặc hiệu, pha loãng mẫu bị dư
Slope là độ dốc của đường chuẩn, là sự khác biệt nhau về chu kỳ ngưỡng giữa các mẫu chuẩn có số lượng giãm dần theo hệ số pha loãng 1/10. 2= 10-1/slope) . Độ dốc – 3,322 cho hiệu quả 100%. Khi đó số lượng mạch khuôn mẫu (template) tăng gấp đôi
sau mỗi chu kỳ khi sự khuếch đại tăng theo cấp số (exponential amplification). Độ nghiêng thấp hơn –3,322 cho thấy hiệu quả phản ứng thấp hơn 100%. Hầu hết các phản ứng đều không đạt tới 100% do các giới hạn thí nghiệm. Độ nghiêng cao hơn - 3,322 cho hiệu quả phản ứng real-time PCR cao hơn 100%. Điều này do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng.
Cách tiến hành xây dựng đường chuẩn định lượng bằng kít Việt Á: Ly tâm, đặt 1 bộ standard (gồm 3 nồng độ đã biết) vào máy real-time PCR cùng với các mẫu thí nghiệm định lượng. Tiến hành cài đặt vị trí mẫu “Plate setup”, loại mẫu là “Standard”, màu “FAM”, khai báo nồng độ standard.
Sau khi real-time PCR xong, chỉ chọn các giếng standard, kiểm tra các standard phải đạt yêu cầu: 102: có tính hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tính hiệu nền ở chu kỳ 31-34; 104: Có tính hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 24-27; 106: Có tính hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 17-20.
Các thông số: hệ số tuyến tính R2 phải nằm trong khoảng 0,960-1,000, tốt nhất 0,990-1,000. Hiệu suất nhân bản – PCR efficiency phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 95-110%. Hệ số dốc phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3,6.
Nếu các đường standard đạt yêu cầu và có các vị trí của đường base line đạt các thông số trên thì standard đạt tiêu chuẩn và có thể tiến hành lấy kết quả. Thông số R2 là quan trọng nhất nên thông số này nằm trong khoảng càng chuẩn thì càng tốt, các thông số khác có thể có sự sai lệch.
Nếu standard không chuẩn, có thể tăng giá trị nồng độ của standard (nếu đường biểu diễn lên sau chu kỳ quy định) hoặc giảm (nếu đường biểu diễn lên trước chu kỳ quy định), nhưng không quá 10 lần. Giá trị tăng hoặc giảm phải phù hợp để có được đường biểu diễn với các thông số đạt chuẩn.
Nếu chỉ có standard hư, lô thí nghiệm vẫn có thể lấy kết quả được thông qua việc vẽ đồ thị so sánh mẫu với những lần thí nghiệm có standard chuẩn.
Tiến hành định lượng mẫu: Cách thực hiện: Hút 2,5 µl cDNA (đã chạy ở bước trên) vào eppendorf LightPoweriVAHCV qPCR mix (do công ty Việt Á sản xuất) đậy nắp eppendorf thật kỹ, ly tâm nhẹ và đặt vào máy real-time PCR theo chu trình nhiệt đã được cài sẵn trong bảng 3.3.
Quy trình thực hiện chạy real-time HCV sử dụng kít LightPoweriVAHCV qPCR có thể được giải thích như sau: 95 0C trong 5 phút giúp cho enzyme Taq polymerase bắt đầu thoát khỏi lớp áo protein (hotstart, Phạm Hùng Vân, 2002), trong gia đoạn này Taq polymerase bắt đầu hoạt động, kết thúc giai đoạn hotstart, chu kỳ luân nhiệt bắt đầu. Chu trình nhiệt cho 40 chu kỳ: 95 0C trong 15 giây, biến tính DNA, cắt đứt các liên kết hydro, các DNA biến thành mạch đơn. 55 0C trong 1 phút giúp cho Taq polymerase hoạt động hiệu quả ngoài ra probe bắt cặp vào trình tự đích, primer bắt đầu bắt cặp vào trình tự đích sau khi probe bắt cặp. 72 0C trong 20 giây là khoảng nhiệt độ và thời gian kéo dài của chuỗi DNA đích khi primer bắt cặp đặc hiệu. Khi quá trình kéo dài bắt đầu thì đầu Q (quencher của probe) sẽ bị cắt đứt và sẽ phát tính hiệu huỳnh quang, mắt đọc huỳnh quang của máy real-time sẽ bắt và mã hóa huỳnh quang.
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt định định lượng HCV cài đặt cho máy real-time PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chy kỳ
95 0C 5 phút 1 chu kỳ
95 0C 15 giây
40 chu kỳ
65 0C 1 phút
(Đọc kết quả tại bước này)
72 0C 20 giây
3.3.5.3. Phương pháp real-time PCR định genotype HCV
Nguyên lý: Mồi và mẫu dò được thiết kế dựa vào vùng 5’NC, tại vùng này có thể phẩn biệt được các genotype dựa vào sự khác nhau của trình tự nucleotide.
Cách thực hiện: thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan. Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần dùng, cất PCR mix lại ngay rồi mới thực hiện các bước tiếp theo. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm nhẹ tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube. Viết ký hiệu và đánh số mẫu lên thành tube vì thiết bị đọc real-time từ nắp của tube.
Thực hiện phản ứng: Cho 2,5 µl dịch cDNA từ phản ứng RT ở trên vào từng tube iVAHCV Genotype 1-6 rPCR Mix và iVAHCV Genotype 2-3 rPCR Mix (mỗi mẫu, kể cả chứng +/- đều phải cho vào cả 2 tube). Phải kiểm tra chắc chắn phần dịch trong tip phải được cho hết vào tube. Thực hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng. thực hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy cơ ngoại nhiễm. Xong, ly tâm nhẹ và đặt các tube vào máy real-time PCR.
Bật máy real-time PCR, nhất là đèn của đầu đọc realtime ít nhất 15 phút trước khi chạy chương trình. Bật máy tính và chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real-time PCR lên. Phải kiểm tra chắc chắn máy real-time PCR và máy tính đã kết nối với nhau. Chọn chức năng chờ cho đến khi “Heat lid” đạt 105 0C thì chương trình luân nhiệt bắt đầu. Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã được đặt trên máy real-time PCR.
Với mẫu: chọn mẫu là “Unknown”. Đặt tên hoặc số tương ứng với ký hiệu của mẫu. Mỗi mẫu có 2 tube tương ứng, đặt tên “Ký hiệu mẫu-1.6” ứng với tube Genotype 1-6, “Ký hiệu mẫu-2.3” ứng với Genotype 2-3.
Với chứng dương và chứng âm: để kiểm tra, nên chọn loại mẫu là “Unknown”. Đặt tên và số ký hiệu tương ứng với mẫu. Không nên chọn “PTC – Possitive control” và “NTC – Negative control”. Đặt tên “Chứng dương”, “Chứng âm” tương ứng.
Chọn màu “FAM” và “HEX” cho tất cả các mẫu, chứng dương và chứng âm.
Bảng 3.4 Chu trình nhiệt định genotype cài đặt cho máy real-time PCR.
Nhiệt độ Thời gian Số chy kỳ
95 0C 5 phút 1 chu kỳ
95 0C 15 giây
40 chu kỳ
65 0C 1 phút
(Đọc kết quả tại bước này)
Quy trình thực hiện chạy real-time HCV sử dụng kít LightPoweriVAHCV Genotype RT-rPCR kít có thể được giải thích như sau: 95 0C trong 5 phút giúp cho enzyme Taq polymerase bắt đầu thoát khỏi lớp áo protein (hotstart, Phạm Hùng Vân, 2008), trong gia đoạn này Taq polymerase bắt đầu hoạt động, kết thúc giai đoạn hotstart, chu kỳ luân nhiệt bắt đầu. Chu trình nhiệt cho 40 chu kỳ: 95 0C trong 15 giây, biến tính DNA, cắt đứt các liên kết hydro, các DNA biến thành mạch đơn, enzyme bắt đầu hoạt động. 65 0C trong 1 phút giúp cho Taq polymerase hoạt động hiệu quả ngoài ra probe bắt cặp vào trình tự đích, primer bắt đầu bắt cặp vào trình tự đích sau khi probe bắt cặp. đây cũng là khoảng nhiệt độ và thời gian kéo dài của chuỗi DNA đích khi primer bắt cặp đặc hiệu. Khi quá trình kéo dài bắt đầu thì đầu Q (quencher của probe) sẽ bị cắt đứt và sẽ phát tính hiệu huỳnh quang, mắt đọc huỳnh quang của máy real-time sẽ bắt và mã hóa huỳnh quang nhận được.
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả chạy real-time RT-PCR
Sau khi kết thúc quá trình real-time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích kết quả. Tùy loại máy, có thể phân tích ở dạng “Linear” hoặc dạng “Log” hoặc cả hai. Trong tube iVAHCV qPCR mix, probe phát hiện tác nhân RNA-HCV được đánh dấu màu FAM, probe phát hiện chứng nội tại được đánh dấu màu HEX. Các kết quả dương tính được nhân với 150 sẽ thu được kết quả hàm lượng virus/ml (copies/ml). Ngưỡng phát hiện của bộ kít là 3 x 102 copies/ml.
4.1.1. Phân tích kết quả mẫu dương tính4.1.1.1. Mẫu dương tính cao 4.1.1.1. Mẫu dương tính cao
Hình 4.1 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dương tính cao.
Ngưỡng định lượng: 3 x 102 copies/ml
Phân tích kết quả: Các thông số của bộ standard: hệ số tương quan R2: 0,996, hiệu suất nhân bản: 98,0%, hệ số dốc – Slope: -3,324 đã đạt yêu cầu và có thể tiến hành lấy kết quả. Chứng [-] cho kết quả [-], chứng tỏ quá trình xét nghiệm không bị ngoại
nhiễm. Mẫu xét nghiệm cho kết quả dương tính ở chu kỳ nhiệt là: Ct =13 => nồng độ RNA-HCV đích trong huyết thanh cao.
Kết quả dương tính được nhân với 150, từ đó tính được hàm lượng khuếch đại số copies/ml máu là: 9,83 x108 copies/ml. Kết quả sau khi nhân với với 150 do >>3 x 102 nên mẫu dương tính cao. Kết luận: Mẫu dương tính nồng độ 9,38 x 108 copies/ml
4.1.1.2. Mẫu dương tính trung bình
Hình 4.2 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dương tính trung bình.
Ngưỡng định lượng: 3 x 102 copies/ml
Phân tích kết quả: Các thông số của bộ standard: hệ số tương quan R2: 0,996, hiệu suất nhân bản: 98,0%, hệ số dốc – Slope: -3,324 đã đạt yêu cầu và có thể tiến hành lấy kết quả. Chứng [-] cho kết quả [-], chứng tỏ quá trình xét nghiệm không bị ngoại nhiễm. Mẫu xét nghiệm cho kết quả dương tính ở chu kỳ nhiệt là: Ct =32,5.
Kết quả dương tính được nhân với 150, từ đó tính được hàm lượng khuếch đại số copies/ml máu là: 3,25 x105 copies/ml.
Kết quả sau khi nhân với với 150 do >3 x 102 nên mẫu dương tính trung bình. Kết luận: Mẫu dương tính với nồng độ là 3,25 x 105 copies/ml.
4.1.1.3. Mẫu dương tính yếu
Hình 4.3 Kết quả chạy real-time PCR mẫu dương tính yếu.
Ngưỡng định lượng: 3 x 102 copies/ml.
Phân tích kết quả: Các thông số của bộ standard: hệ số tương quan R2: 0,999, hiệu suất nhân bản: 98,0%, hệ số dốc – Slope: -3,324 đã đạt yêu cầu và có thể tiến hành lấy