Nguyên tắc: Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng nhất là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform/nước).
RNA là các phân tử mạch đơn kém bền, khi tách chiết cần lưu ý tránh mọi tác nhân cơ học hay hóa học qía mạnh có thể làm đút gãy chúng.
Bước 1: Phá màng tế bào và màng nhân bằng các tác nhân vật lý, hóa học hoặc kết hợp nhiều tác nhân, giải phóng RNA ra môi trường.
Bước 2: Kết hợp chloroform và phenol loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu (protein, lipid, polysaccharide và lượng phenol ở bước 1). Sau đó đem ly tâm, protein biến tính sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha phenol- chloroform, thu nhận lại pha trước chứa nucleic acid.
Bước 3: Tủa nucleic acid. Thường dùng ethanol thể tích 2,5:1 trong môi trường lực ion cao (nồng độ muối cao) hoặc dùng isopropanol thể tích 1:1. Cặn nucleic thu được bằng ly tâm được hòa trong nước cất 2 lần đã xử lý với DEPC để bảo quản. Quy trình tách chiết RNA được tiến hành như sau:
Đánh dấu các tube 1,5ml biopure bằng kí hiệu mẫu.
Cho 200µl mẫu vào 1tube biopure có sẵn 900µl dung dịch pER1, vortex 30s, để yên trong 10 phút.
Thêm 200µl dung dịch pEX2, trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong tube phải chuyển sang màu trắng đục. Để yên 10 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Thu 600µl dịch nổi có chứa RNA vào 1 tube biopure có sẵn 600µl dung dịch pEX3. Trộn đều, để yên trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng. Cho từ từ 900µl dung dịch EX4 vào. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Để khô ở 60 0C trong 10 – 15 phút. Cho vào 50µl dung dịch ER5. Trước khi sử dụng dùng pipet trộn đều cho đến khi phần cặn tan hoàn toàn. Bảo quản mẫu ở -20 0C. Lưu trữ mẫu lâu phải bảo quản ở -70 0C với RNase inhibitor.
3.3.5. Phương pháp real-time RT-PCR
Phương pháp real-time RT-PCR hai bước sử dụng cho định lượng và định genotype được tiến hành bước đầu là chạy RT tạo cDNA từ RNA-HCV và sau đó tiến hành phương pháp real-time PCR.