Sau khi kết thúc quá trình real-time PCR, chuyển sang chế độ “Analysis” để phân tích kết quả. Tùy thuộc máy, có thể phân tích đồ thị ở dạng “Linear” hoặc dạng “Log” hoặc cả hai. Trong tube iVAHCV Genotype 1-6 rPCR mix, probe phát hiện genotype 1 được đánh dấu với màu HEX, probe phát hiện genotype 6 được đánh dấu với màu FAM. Trong tube iVAHCV Genotype 2-3 rPCR mix, probe phát hiện genotype 2 được đánh dấu với màu FAM, probe phát hiện genotype 3 được đánh dấu với màu HEX.
4.2.1. Genotype 1
Hình 4.7 Đồ thị biểu diễn nhiễm genotype 1.
1, 2, 3, 6: Genotype 1, 2, 3, 6. D: Chứng âm.
Phân tích kết quả: chứng dương có đường biểu diễn huỳnh quang tuyến tính vượt quá tính hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) của mày FAM với genotype 2-6 và màu HEX với genotype 1-3, còn chứng âm có đường biểu diễn thẳng và không vượt qua tính hiệu nền(đường biểu diễn âm tính) với cả hai màu. Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục phân tích kết quả. Genotype 1 dương tính rõ và cắt baseline ở Ct = 30,6. Các genotype 6, genotype 2, genotype 3 âm tính. Kết luận: Mẫu nhiễm genotype 1.
4.2.2. Genotype 6
Hình 4.8 Đồ thị biểu diễn nhiễm genotype 6.
1, 2, 3, 6: Genotype 1, 2, 3, 6. D: Chứng âm.
Phân tích kết quả:
Chứng dương có đường biểu diễn huỳnh quang tuyến tính vượt quá tính hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) của mày FAM với genotype 2-6 và màu HEX với genotype 1-3, còn chứng âm có đường biểu diễn thẳng và không vượt qua tính hiệu nền (đường biểu diễn âm tính) với cả hai màu. Thí nghiệm đạt yêu cầu và tiếp tục phân tích kết quả. Genotype 6 dương tính rõ và cắt baseline ở Ct = 36. Các genotype 1, genotype 2, genotype 3 âm tính. Kết luận: Mẫu nhiễm genotype 6.
4.3. Tình hình nhiễm HCV tại bệnh viện 175
Bảng 4.1 Kết quả chạy real-time PCR 28 mẫu huyết thanh
Kết quả Số lượng Tỷ lệ (%)
Dương tính 4 14%
Dương tính dưới ngưỡng 5 18%
Âm tính 19 68%
Tổng 28 100%
14.02%
17.88%
68.10%
Dương tính Dương tính dưới ngưỡng Âm tính
Hình 4.9 Biểu đồ phân bố nhiễm HCV của bệnh nhân tại bệnh viện 175.
Nhận xét kết quả : Theo kết quả nghiên cứu thu được: Trong số 28 bệnh nhân có anti-HCV [+] được thực hiện xét nghiệm real-time PCR có 9 trường hợp bao gồm dương tính và dương tính dưới ngưỡng chiếm tỷ lệ 32%, 18 trường hợp âm tính chiếm tỷ lệ 68%.
Thảo luận: Theo kết quả ở 2 nhóm thực hiện RNA-HCV, ta thấy chỉ có 32% trường hợp Anti-HCV [+] là có mang RNA-HCV, chứng minh là có mang vi rút dạng hoạt động. Các trường hợp anti-HCV [+], RNA-HCV [-] có thể do: bệnh nhân đã nhiễm và đã khỏi bệnh, chỉ còn kháng thể tồn tại.
Kết quả nghiên cứu thu được có tỷ lệ dương tính 32%. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết Vân (2007), nghiên cứu trên 85 mẫu huyết thanh cho kết quả là: tỷ lệ nhiễm RNA-HCV là 82 %. Sở dĩ có kết quả nghiên cứu có tỷ lệ dương tính khác nhau như vậy là do:
Đối tượng nghiên cứu khác nhau. Trong đề tài này chúng tôi thực hiện nghiên cứu trên những bệnh nhân có anti-HCV [+] tại bệnh viện 175, những bệnh nhân này không rõ nguyên nhân và thời gian bị nhiễm HCV. Còn trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết Vân đối tượng là những phạm nhân nghiện chích ma túy tại trại giam Đăk
Trung, Gia Trung và Trung tâm giáo dục xã hội của Tây Nguyên đã biết rõ những thông tin trên. Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), những đối tượng nguy cơ nhiễm HCV thì đối tượng tiêm chích ma túy thuộc đối tượng nhiễm và lây nhiễm HCV cao.
Sự thiết kế mồi và mẫu dò cả hai nghiên cứu đều dựa vào vùng 5’NC. Tuy nhiên, kỹ thuật trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết Vân là RT-PCR, còn trong nghiên cứu của chúng tôi là real-time RT-PCR. Theo Phạm Hùng Vân (2008) kỹ thuật real- time PCR có độ nhạy và tin cậy cao hơn RT-PCR. Ngoài định tính thì kỹ thuật real- time PCR còn cho biết lượng copies theo thời gian thật (real-time).
Số mẫu nghiên cứu tại bệnh viện 175 là 28 mẫu huyết thanh. Số mẫu này tương đối ít so với số mẫu trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Tuyết Vân là 85 mẫu huyết thanh. Với số mẫu 28 thì chưa có ý nghĩa về mặt thống kê.
Ý nghĩa về mặt dịch tễ học: Nước ta là nước đang phát triển, chưa đầy đủ các hạ tầng cơ sở về y tế cộng đồng, kế hoạch dự phòng nhiễm HCV chưa được chú trọng. Giáo dục và cố vấn kiến thức về bệnh và các đối tượng nguy cơ để ngăn ngừa lây nhiễm là chưa cao. Bệnh viêm gan C diễn biến âm thầm, người nhiễm siêu vi C lây nhiễm trong cộng đồng vì không biết mình đã nhiễm và mắc bệnh viêm gan do HCV.
4.4. Kết quả xác định genotype HCV
Trong 9 mẫu huyết thanh dương tính RNA-HCV có nồng độ ≥ 3 x 102 copies/ml mang đi định genotype cho kết quả dưới đây.
Bảng 4.2 Kết quả định genotype Genotype HCV Số lượng 1 3 2 0 3 0 6 1 Tổng 4
Nhận xét kết quả: Số lượng bệnh nhân nhiễm genotype 1 là 3 trường hợp và số lượng bệnh nhân nhiễm genotype 6 là 1, không có trường hợp nhiễm genotype 2 và genotype 3.
Thảo luận: Theo kết quả như trình bày trong bảng 4, các type chủ yếu là type 1 và 6. Với type 1 là type khó đáp ứng với điều trị đặc hiệu, đồng thời cũng chiếm tỷ lệ cao trong các trường hợp tái phát. Type 6 thường chỉ gặp ở vùng Đông Nam Á nên khả năng đáp ứng điều trị đặc hiệu chưa có nhiều nghiên cứu.
Vùng xác định genotype HCV mà Việt Á sử dụng để thiết kế mồi và mẫu dò là vùng 5’NC. Theo Phạm Hùng Vân (2008) thì đây là vùng rất bảo tồn trong bộ gen HCV và nhạy cảm nhất cho chẩn đoán. Công ty Nam Khoa cũng lựa chọn vùng này để định lượng và định genotype. Nguyên tắc định genotype mà Nam Khoa thực hiện là kết hợp real-time PCR và giải trình tự vùng 5’NC sau đó so sánh với ngân hàng dữ liệu NCBI. Phương pháp này cho kết quả chính xác tuy nhiên rất tốn kém và thời gian chẩn đoán dài (24 giờ). Trong khi đó, Việt Á chỉ sử dụng mẫu dò đặc hiệu và mồi đặc hiệu cũng có thể định genotype một cách nhanh chống (3 giờ).
Số lượng mẫu là 4, chưa có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu số lượng lớn thì phân bố genotype 1 và 6 như sau: theo Nguyễn Thanh Hảo và ctv, thực hiện trên 123 đối tượng cho máu tình nguyện, số người nhiễm genotype HCV type1: 86 người; type6: 37 người. Phòng thí nghiệm NK-Biotek năm 2008 có kết quả trong 2000 mẫu huyết thanh được gửi làm xét nghiệm định genotype thì genotype 1 có 1160 ca, genotype 6 là 340 ca, còn lại là genotype 2 và genotype 3. (trích dẫn bởi Phạm Hùng Vân, 2008). Như vậy, type HCV chủ yếu ở Việt Nam là type 1 và 6.
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Tỷ lệ dương tính RNA-HCV của bệnh nhân có anti-HCV [+] là 32%. Kiểu genotype 1 có 3 trường hợp, kiểu gen 6 là 1 trường hợp.
5.2. Kiến nghị
Các nhận xét trên đây chỉ là bước đầu dựa trên 28 trường hợp nghiên cứu, nếu có điều kiện chúng tôi xin được tiếp tục được nghiên cứu với với số lượng lớn hơn để có đưa ra những nhận xét khách quan hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Hoàng Chương. 2003-2005. Xây Dựng Quy Trình Định Lượng Vi rút Viêm Gan Siêu Vi C (HCV) Bằng Kỹ Thuật Real-time RT-PCR (reverse transcription polemerase chain reaction). Luận Văn Thạc Sĩ Sinh Học, Đại Khoa Học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.
2. Hồ Huỳnh Thùy Dương. 2008. Sinh học phân tử, tái bản lần 5. Nhà xuất bản giáo dục, Tp. Hồ Chí Minh. Trang 196-209.
3. Đinh Dạ Lý Hương – Bùi Hữu Hoàng – Võ Thị Mỹ Dung – Trần Thiện Tuấn Huy – Trần Ngọc Bảo. 2000. Viêm Gan Siêu Vi C - Từ cấu trúc siêu vi đến điều trị. Nhà xuất bản Y học, Tp. Hồ Chí Minh. Trang 7-23, 42-45. 4. Trương Thị Xuân Liên. 1994. Tình hình nhiễm virus Viêm Gan C tại Thành
phố Hồ Chí Minh. Luận Văn phó tiến sĩ chuyên ngành sinh học vi sinh, Khoa Học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh.
5. Nguyễn Thanh Thảo. 2006. Vi-rút học. Nhà xuất bản Y học, Tp. Hồ Chí Minh. Trang 177-198.
6. Nguyễn Đình Thi – Nông Văn Hải. 2008. Những Kỹ Thuật PCR và ứng dụng trong phân tích. Nhà xuất bản Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ, Hà Nội. Trang 28-40, 404-437.
7. Phạm Hùng Vân. 2009. PCR và real-time PCR - Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp. Nhà xuất bản Y học, Tp. Hồ Chí Minh. Trang 34-67, 95-108.
8. Nguyễn Thị Tuyết Vân. 2007. Tình hình nhiễm virus viêm gan C trên người nghiện chích ma túy tại trại giam Đăk Trung, Gia Trung và Trung tâm giáo dục xã hội của Tây Nguyên. Luận văn thạc sĩ y học, Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh.
TÀI LIÊU TIẾNG ANH
9. WHO (1999). Hepatitis C: global prevalence, Weekly Epidermiological Record, 72(46).
10. Philippe Halfon, Marc Bourlière, Guillaume Pénaranda, Hacène Khiri, and Denis Ouzan4. 2006. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY. “Real-
Time PCR Assays for Hepatitis C Virus (HCV) RNA Quantitation Are Adequate for Clinical Management of Patients with Chronic HCV Infection”, p. 2507–2511.
11. Philippe Halfon, Christa Roubicek, Victoria Gerolami, Yves Quentin, Hacene Khiri, Gérad Pepe and Yvon Berland, Apr. 2002. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, “Use of Phylogenetic Analysis of Hepatitis C Virus (HCV) Hypervariable Region 1 Sequences To Trace an Outbreak of HCV in an Autodialysis Unit”, p. 1541–1545
TÀI LIÊU WEB
12. http://www.tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/3n_.E1.BB.A9ng.html 13. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/index.html 14. http://www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 15. http://www.nathnac.org/pro/factsheets/hep_c.htm 16. http://www.drthuthuy.com/reseach/XetNghiemVGC.htm 17. http://www.epgonline.org/hepatitisgenotype.aspx 18. http://www.ahvinhnghiem.org/images/ViemganC.jpg 19. http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/ Hepatitis_C_virus_patients.aspx