Nguyên lý: định lượng nồng độ RNA-HCV phải dựa vào đường chuẩn được xây dựng với bộ kít iVAqPCR 3Standard Kít do công ty Việt Á sản xuất sử dụng 3 nồng độ định lượng là 102, 104, 106.
Phân tích đường biểu diễn chuẩn: Đây là một đường thẳng tuyến tính đi qua các điểm tọa độ xác định bởi số lượng bản DNA đích ban đầu của từng mẫu chuẩn. Có hai thông số được máy tính toán và hiển thị trên một đường biểu diển chuẩn. Hai thông số này rất có giá trị để người làm thử nghiệm có thể đánh giá được thao tác pipetting của mình trong quá trình thử nghiệm.
Thông số về Hệ số tương quan R2 đánh giá độ chính xác của thao tác pipetting lấy có đúng thể tích mong muốn hay không. Trị số R2 phải đạt là trên hay bằng 0.99 có nghĩa là đường biểu diễn chuẩn đạt tuyến tính cao. Khi người làm thử nghiệm không lấy được thể tích chính xác thì chắc chắn các thể tích mẫu chuẩn cho vào real–time PCR mix sẽ không thể nào chính xác được nên R2 sẽ không thể nào đạt được >= 0.99
Thông số về Hiệu quả PCR là E ( PCR efficiency) hiệu quả phản ứng sẽ cho biết các thông tin có giá trị về hóa chất phản ứng.
E% = (10-1/slope – 1) x 100% Chấp nhận : 90 105%
E% < 90% : Mồi không nhạy, pha loãng mẫu bị thiếu E% >105% : Mồi không đặc hiệu, pha loãng mẫu bị dư
Slope là độ dốc của đường chuẩn, là sự khác biệt nhau về chu kỳ ngưỡng giữa các mẫu chuẩn có số lượng giãm dần theo hệ số pha loãng 1/10. 2= 10-1/slope) . Độ dốc – 3,322 cho hiệu quả 100%. Khi đó số lượng mạch khuôn mẫu (template) tăng gấp đôi
sau mỗi chu kỳ khi sự khuếch đại tăng theo cấp số (exponential amplification). Độ nghiêng thấp hơn –3,322 cho thấy hiệu quả phản ứng thấp hơn 100%. Hầu hết các phản ứng đều không đạt tới 100% do các giới hạn thí nghiệm. Độ nghiêng cao hơn - 3,322 cho hiệu quả phản ứng real-time PCR cao hơn 100%. Điều này do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng.
Cách tiến hành xây dựng đường chuẩn định lượng bằng kít Việt Á: Ly tâm, đặt 1 bộ standard (gồm 3 nồng độ đã biết) vào máy real-time PCR cùng với các mẫu thí nghiệm định lượng. Tiến hành cài đặt vị trí mẫu “Plate setup”, loại mẫu là “Standard”, màu “FAM”, khai báo nồng độ standard.
Sau khi real-time PCR xong, chỉ chọn các giếng standard, kiểm tra các standard phải đạt yêu cầu: 102: có tính hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tính hiệu nền ở chu kỳ 31-34; 104: Có tính hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 24-27; 106: Có tính hiệu huỳnh quang tuyến tính bắt đầu vượt quá tín hiệu nền ở chu kỳ 17-20.
Các thông số: hệ số tuyến tính R2 phải nằm trong khoảng 0,960-1,000, tốt nhất 0,990-1,000. Hiệu suất nhân bản – PCR efficiency phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 95-110%. Hệ số dốc phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3,6.
Nếu các đường standard đạt yêu cầu và có các vị trí của đường base line đạt các thông số trên thì standard đạt tiêu chuẩn và có thể tiến hành lấy kết quả. Thông số R2 là quan trọng nhất nên thông số này nằm trong khoảng càng chuẩn thì càng tốt, các thông số khác có thể có sự sai lệch.
Nếu standard không chuẩn, có thể tăng giá trị nồng độ của standard (nếu đường biểu diễn lên sau chu kỳ quy định) hoặc giảm (nếu đường biểu diễn lên trước chu kỳ quy định), nhưng không quá 10 lần. Giá trị tăng hoặc giảm phải phù hợp để có được đường biểu diễn với các thông số đạt chuẩn.
Nếu chỉ có standard hư, lô thí nghiệm vẫn có thể lấy kết quả được thông qua việc vẽ đồ thị so sánh mẫu với những lần thí nghiệm có standard chuẩn.
Tiến hành định lượng mẫu: Cách thực hiện: Hút 2,5 µl cDNA (đã chạy ở bước trên) vào eppendorf LightPoweriVAHCV qPCR mix (do công ty Việt Á sản xuất) đậy nắp eppendorf thật kỹ, ly tâm nhẹ và đặt vào máy real-time PCR theo chu trình nhiệt đã được cài sẵn trong bảng 3.3.
Quy trình thực hiện chạy real-time HCV sử dụng kít LightPoweriVAHCV qPCR có thể được giải thích như sau: 95 0C trong 5 phút giúp cho enzyme Taq polymerase bắt đầu thoát khỏi lớp áo protein (hotstart, Phạm Hùng Vân, 2002), trong gia đoạn này Taq polymerase bắt đầu hoạt động, kết thúc giai đoạn hotstart, chu kỳ luân nhiệt bắt đầu. Chu trình nhiệt cho 40 chu kỳ: 95 0C trong 15 giây, biến tính DNA, cắt đứt các liên kết hydro, các DNA biến thành mạch đơn. 55 0C trong 1 phút giúp cho Taq polymerase hoạt động hiệu quả ngoài ra probe bắt cặp vào trình tự đích, primer bắt đầu bắt cặp vào trình tự đích sau khi probe bắt cặp. 72 0C trong 20 giây là khoảng nhiệt độ và thời gian kéo dài của chuỗi DNA đích khi primer bắt cặp đặc hiệu. Khi quá trình kéo dài bắt đầu thì đầu Q (quencher của probe) sẽ bị cắt đứt và sẽ phát tính hiệu huỳnh quang, mắt đọc huỳnh quang của máy real-time sẽ bắt và mã hóa huỳnh quang.
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt định định lượng HCV cài đặt cho máy real-time PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chy kỳ
95 0C 5 phút 1 chu kỳ
95 0C 15 giây
40 chu kỳ
65 0C 1 phút
(Đọc kết quả tại bước này)
72 0C 20 giây