Tổng quan về tyrosynase, nguyên liệu nghiên cứu, cơ chế hình thành các phản ứng chuyển hóa enzyme và cơ chế của chúng
Điều chế 21 mẫu cao chiết từ phụ phẩm (vỏ, vỏ lụa, hạt, hạt ngâm ) của bốn loại bơ hiện nay ở Việt Nam ( bơ sáp, bơ nước, bơ booth, bơ 034) bằng phương pháp ngâm dầm với dung môi là ethanol : H2O (tỉ lệ 7:3).
16
Sàng lọc hoạt tính ức chế tyrosynase và khả năng khử Cu2+ từ 21 mẫu cao
Lựa chọn các mẫu cao có tiềm năng ức chế tyrosynase để đánh giá thành phần hóa học, hoạt tính kháng khuẩn và thử nghiệm độc tính để định hướng nghiên cứu ứng dụng thực tế sau này.
Xử lí số liệu, đánh giá kết quả đạt được từ đó áp dụng mẫu cao.
CHƯƠNG 2.THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu
Nguyên liệu được sử dụng là các phụ phẩm (vỏ, vỏ lụa, hạt) của 4 loại bơ phổ biến ở Việt Nam hiện nay (bơ nước, bơ sáp, bơ booth, bơ 034) . Các loại phụ phẩm này được
17
lấy trực tiếp từ quả bơ mà nhóm nghiên cứu đã qua sử dụng, một số được thu gom được từ các quán sinh tố, quán ăn khu vực quận Thủ Đức và Dĩ An từ tháng 9/2018. Nguồn nguyên liệu sau khi thu gom được rửa sạch, thái lát, sấy khô và bảo quản trước khi thực nghiệm.
Dùng hỗn hợp các mẫu cao thành phần tất cả cả mẫu hạt, hạt ngâm, vỏ, hạt và vỏ, hạt và vỏ và vỏ lụa để tạo ra các mẫu cao hỗn hợp tương ứng.
2.2 Hóa chất và thiết bị
- Ethanol (EtOH) 99,5o (Chemsol, Việt Nam).
- Disodium hydrophosphate (Na2HPO4.12H2O) (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Monosodium orthophosphate (NaH2PO4.2H2O) (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Enzyme tyrisinase from Mushoom ( Sigma-Aldrich, USA) - L-3,4-Dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) (Sigma-Aldrich, USA)
- Kojic acid ( 2-Hydroxymethyl-5-hydroxy-γ-pyrone)(Sigma-Aldrich, USA)
- BCDS (bathocuproinedisulfonic disodium) (Sigma-Aldrich, USA)
- Copper(II) Chloride (CuCl2)(Sigma-Aldrich, USA)
- MOPS (Acid 4-Morpholinepropanesulfonic)(Sigma-Aldrich, USA)
- Potasium Iodide (KI) (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Iodine (I2) (Xilong Chemical, Trung Quốc)
- Methanal ( HCHO ) (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Hydrochloric acid (HCl) (Xilong Chemical, Trung Quốc) - Bể điều nhiệt (Memmert, Đức)
- Cuvette thủy tinh (Chrom Tech, USA)
- Hệ thống cô quay chân không (Yamamoto, Nhật Bản) - Máy đo độ hấp thu quang UV-Vis (Hitachi, Nhật Bản) - Máy đo pH (Seven easy pH, Trung Quốc)
18
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát
Thuyết minh sơ đồ nghiên cứu
Bảng 2.1 Các mẫu phụ phẩm bơ được nghiên cứu
Nguyên liệu Điều chế cao trích Trích ly (pp ngâm dầm) EthOH: H2O (7:3) Cô quay 21 mẫu cao trích Tính hiệu suất trích ly Xác định khả năng ức chế enzyme tyrosynase Khảo sát khả năng ức chế Cu2+
Chọn mẫu cao hoạt tính tốt nhất Sơ bộ thành phần hóa học Xác định hoạt tính kháng khuẩn Xác định khả năng gây độc tế bào - Thu nhận - Rửa sạch - Thái lát
-Sấy khô, nghiền
Xác định độ ẩm Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3
19
STT Kí hiệu Mẫu Bộ phận sử dụng
1 N-H Hạt bơ nước Hạt
2 N-HN Hạt bơ nước ngâm Hạt ngâm 24h
3 N-V Vỏ bơ nước Vỏ
4 N-VL Vỏ lụa bơ nước Vỏ lụa
5 S-H Hạt bơ nước Hạt
6 S-HN Hạt bơ nước ngâm Hạt ngâm 24h
7 S-V Vỏ bơ nước Vỏ
8 S-VL Vỏ lụa bơ nước Vỏ lụa
9 B-H Hạt bơ nước Hạt
10 B-HN Hạt bơ nước ngâm Hạt ngâm 24h
11 B-V Vỏ bơ nước Vỏ
12 B-VL Vỏ lụa bơ nước Vỏ lụa
13 O-H Hạt bơ nước Hạt
14 O-HN Hạt bơ nước ngâm Hạt ngâm 24h
15 O-V Vỏ bơ nước Vỏ
16 O-VL Vỏ lụa bơ nước Vỏ lụa
17 HH-H Hỗn hợp hạt Hạt 18 HH-HN Hỗn hợp hạt ngâm Hạt ngâm 24h 19 HH-V Hỗn hợp vỏ Vỏ 20 HH-HV Hỗn hợp hạt và vỏ Hạt + vỏ 21 HH-HVL Hỗn hợp hạt + vỏ + vỏ lụa Hạt + vỏ + vỏ lụa ➢ Giai đoạn 1:
20
phân loại bơ nước, bơ sáp, bơ booth và bơ 034, xử lý sơ bộ, sấy khô, nghiền thành bột. Đối với hạt bơ loại kháng dưỡng, hạt được thái nhỏ, ngâm trong nước trong 24h, sấy khô rồi mới xay thành bột.
Trích ly bằng phương pháp ngâm dầm sử dụng dung môi EtOH : H2O theo tỷ lệ 7:3.
Bột cao được ngâm trong bình tối màu với lượng dung môi gấp 3 lần so với lượng bột ngâm.
Sau mỗi 24h, dịch chiết được lọc lại 2 lần rồi bảo quản. Sau 4 ngày tiến hành lọc lại và cô quay thu hồi dung môi trong điều kiện áp suất thấp, thu nhận cao trích và tính hiệu suất trích ly mẫu. Các mẫu cao trích được kí hiệu như bảng sau 2.1
➢ Giai đoạn 2:
Sau khi đã điều chế mẫu cao trích, tiến hành thử hoạt tính ức chế tyrosynase và khảo
sát khả năng khử Cu2+. Từ đó, dựa trên kết quả ức chế tyrosynase mạnh cũng như khả năng
tạo phức chelate tốt, chọn 1 mẫu cao có hoạt tính mạnh thực hiện tiếp giai đoạn 3
➢ Giai đoạn 3:
Mẫu cao được chọn sẽ được khảo sát sơ bộ một số thành phần hóa học. Ngoài ra, để đánh giá khả năng ứng dụng cho mỹ phẩm sau này, mẫu cao này sẽ được xác định khả năng
kháng khuẩn với 4 dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus và Pseudomonas aeruginosa,
Salmonella và Bacillus Ceraus cũng như đánh giá phần trăm gây độc tế bào trên dòng tế
bào Hep-G2 (ung thư gan ).
2.3.2Điều chế cao trích
Cao trích được điều chế từ 50g bột cao mỗi loại cho vào bình tối màu, sau 24h thay dung môi 1 lần. Sau 4 ngày gom tất cả dịch chiết lọc 2 lần rồi tiến hành cô quay đuổi dung
môi bằng hệ thống cô quay chân không (Yamamoto, Nhật Bản) ở điều kiện 50o C, tốc độ
quay 90 vòng/phút, cô quay đến khi lượng dung môi thu hồi gần hết, thu dịch cao chiết cho
vào đĩa pitri. Sản phẩm được sấy ở nhiệt độ 60o C bằng tủ sấy (Memmert, Đức) sau đó thu
21
2.3.3Xác định khả năng ức chế tyrosynase
➢ Nguyên tắc
Trong môi trường pH = 6.8 tyrosynase chuyển hóa chất L- DOPA thành
DOPAchrom có màu đỏ cam hấp thụ bước sóng cực đại λmax = 475nm [53]. Mẫu cao trích
được cho vào dung dịch đệm gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, từ đó việc chuyển hóa L- DOPA sẽ giảm đi, cường độ hấp thụ màu cũng sẽ giảm [54]. Từ kết quả đo độ hấp thụ ở các nồng độ khác nhau mà chúng ta có thể đánh giá khả năng ức chế enzyme của các
mẫu cao trích thông qua phần trăm ức chế và giá trị IC50.
Hình 2.2 Cơ chế chuyển hóa L-DOPA dưới tác dụng tyrosynase
Đệm phosphat (0,1 M) pH = 6,8: đong 140 mL dung dịch Na2HPO4 0,2 M và 144
mL dung dịch NaH2PO4 0,5 M đổ vào becher 1000 mL. Thêm nước cất 1 lần và chỉnh đệm
đến pH = 6,8. Sau đó định mức trong fiol 1000 mL. Mẫu chuẩn bị nồng độ đầu là 1000μg/ mL
Chất nền L-DOPA (1,5 mM) cân 29,58 mg L-DOPA. Pha trong fiol 100 mL định
mức bằng đệm phosphate
Enzym tyrosynase from mushroom: 2687U/mg pha trong 83mL đệm phosphate.
22
Hình 2.3 Sơ đồ quy trình ức chế tyrosynase
➢ Thuyết minh quy trình
Mẫu được chuẩn bị với nồng độ 1000μg/ mL với đệm phosphate. Mẫu cao và lượng
đệm cần thiết sau khi thêm 100μL tyrosynase 300U.mL-1 thì được ủ trong tủ lạnh trong 30
phút. Sau đó, hỗn hợp được thêm vào 1000μL chất nền L-DOPA, lắc đều và đợi trong 7
phút rồi tiến hành đo quang tại bước sóng λmax= 475 nm.
Tổng thể tích cho mỗi dung dịch cần đo là 3000μL. Mẫu được sử dụng ở nồng độ làm việc lần lượt là 100, 50, 25, 10, 5μg/mL. Song song với việc chuẩn bị dung dịch mẫu thử là dung dịch mẫu trắng và mẫu đối chứng. Dung dịch mẫu trắng sẽ chứa lượng chất nền tương tự như mẫu đo, tuy nhiên lượng enzyme sẽ được thay bằng lượng đệm tương ứng. Mẫu đối chứng là dung dịch không chứa mẫu cao trích.
Mỗi mẫu nồng độ sẽ được đo 3 lần và lấy giá trị trung bình. Ứng với mỗi giá trị
trung bình, ta tính được phần trăm ức chế enzyme từng nồng độ, từ đó xác định được IC50
của mẫu và so sánh giữa các mẫu với nhau. Mẫu nhận giá trị IC50 càng bé chứng tỏ khả
V1 μL mẫu V2 μL đệm (pH=6.8)
V3 μL enzyme
V4 μL nền L-DOPA
Đo độ hấp thu quang tại 475nm Ủ 30 phút trong
tủ lạnh
23
năng ức chế enzyme càng hiệu quả.
Phần trăm ức chế được tính theo công thức:
I% = 𝐴−𝐵
𝐴 × 100
Trong đó: A,B- Hoạt tính ức chế PPO từ mẫu control và mẫu cao
Cơ sở để đánh giá khả năng ức chế của những mẫu khảo sát được so sánh với chất đối chứng dương. Trong nghiên cứu này, acid kojic được chọn làm chất đối chứng dương, acid kojic là chất ức chế enzym tyrosinase mạnh.
2.3.4Khảo sát khả năng khử Cu2+
➢ Nguyên tắc
Theo nghiên cứu của Mira và cộng sự (2002) [55] thì trong môi trường đệm pH=7.2-
7.4, phức đồng BCDS2Cu(I) được phát hiện màu đỏ cam tại bước sóng 480nm. Sự có mặt
của flavonoid trong thành phần mẫu cao bơ làm cho lượng Cu2+ chuyển hóa thành Cu+ (hình
2.4), và lúc đó phức chất BCDS2Cu(I) có màu đỏ cam được hình thành (hình 2.5). Phức
chất này chỉ tồn tại với ion Cu+ [56]. Vì vậy, ở nồng độ càng cao, mẫu cao trích sẽ có thành
phần flavonoid càng nhiều, phức chất tạo ra càng đậm màu.
Cơ chế : Theo nghiên cứu của M. Tereza Fernandez (1995) và David DA (2002) cùng cộng sự [57, 58] (hình 2.4, hình 2.5).
24
Hình 2.5 Cơ chế tạo phức đồng Chalate giai đoạn 2
➢ Sơ đồ quy trình
Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát khả năng tạo phức với Cu2+
V1 μL mẫu V2 μL MOPS (pH=7.4)
V3 μL CuCl2
V4 μL BCDS
Đo độ hấp thu quang tại 480nm
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2h
25 ➢ Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị hóa chất
- Mẫu chuẩn Catechin chuẩn bị với nồng độ 350μM
- Dung dịch BCDS 3600μM
- Dung dịch CuCl2 800μM
- Đệm MOPS pH = 7.4
- Các mẫu cao chuẩn bị ở nồng độ chuẩn 10mg/mL
Thuyết minh quy trình
Quy trình khảo sát dựa vào cải tiến của Mira và cộng sự [55], với các dung dịch khảo
sát có nồng độ chuẩn như đã nêu. Tiến hành khảo sát thể tích các dung dịch để tìm ra V1,
V2, V3, V4 là các điều kiện thể tích tối ưu.
Với tổng dung dịch mỗi lần khảo sát là 3000μL, lần lượt khảo sát thể tích các dung
dịch CuCl2, BCDS, catechin (mẫu) bằng cách cố định các thể tích khác thông qua nồng độ
làm việc tương ứng. Ủ dung dịch sau 2h, thực hiện scan bước sóng từ 300 - 800nm, ứng
với vị trí có λmax là độ hấp thu quang của mẫu . Lựa chọn thể tích tối ưu là tại đó có độ hấp
thu quang cao nhất. Tiếp tục khảo sát các thể tích tiếp theo sau khi cố định thể tích đã khảo sát trước đó. Thể tích MOPS cần tối ưu là phần còn lại trong 3000μL.
Sau khi tối ưu hóa, thực hiện đo độ hấp thu quang trên các mẫu cao với các nồng độ làm việc là 1.0mg/mL, 0.5mg/mL, 0.1mg/mL. Cho hỗn hợp lượng mẫu và các thành phần khác theo kết quả đã tối ưu ủ sau 2h. Tiến hành đo độ hấp thu và so sánh kết quả.
2.3.5Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học có trong mẫu cao
Đối với mẫu cao có hoạt tính sinh học cao, cùng với xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư thì việc khảo sát sơ bộ thành phần hóa học chính của mẫu cao này giúp dễ dàng hơn trong việc phối hợp các thành phần cho sản phẩm sau này. Phương pháp khảo sát sơ bộ được thể hiện trong bảng 2.2 dưới đây.
26
Bảng 2.2 Phương pháp định danh thành phần hóa học
Phương pháp Nhận biết
Alkaloid [59, 60]
Thuốc thử Mayer 1.36g HgCl2 + 5g KI + nước cất đến 100mL.
Kết tủa trắng hoặc vàng nhạt xuất hiện khi cho thuốc thử vào dung dịch acid của mẫu.
Thuốc thử Wagner 1.27g I2 + 2g KI + nước cất đến 100mL.
Kết tủa nâu xuất hiện khi cho thuốc thử vào dung dịch acid của mẫu.
Saponin
Tính tạo bọt trong nước [61]
Cao (1g) + ethanol (5mL), đun cách thủy/5phút. Lọc lấy dung dịch alcol để thử nghiệm trong 2 ống nghiệm có kích cỡ bằng nhau. + Ống 1: 5mL HCl 0.1N (pH=1) + 3 giọt dung dịch lọc + Ống 2 : 5mL NaOH 0.1N (pH =13) + 3 giọt dd lọc Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát cột bọt bong bóng trong 2 ống nghiệm.
+ Cột bọt bằng nhau và bền bọt như nhau: Có thể có saponin triterpenoid
27
+ Cột bọt ống 2 cao hơn nhiều so với ống 1: Có thể có saponin steroid
Phản ứng LieBermann- Burchard [62]
1ml anhydrid acetic+ 1mL chloroform rồi làm lạnh, cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc. Cho mẫu vào ở dạng rắn hoặc chloform, nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ-xanh lá, còn dẫn chất
triterpenoid thì có màu hồng đến tía.
Anthocyanydin [63]
HCl Trong điều kiện pH thấp, sự có mặt của Anthocyanidin dẫn đến hợp chất có màu, ngược lại thì không. Dùng acid HCl đđ để nhận biết sự có mặt của Anthocyanidin ( xuất hiện màu )
Proanthocyanin [63]
HCl đđ Cho mẫu cao bơ hòa tan trong dung dịch cồn, đun cách thủy với HCl 10% trong 10phút sự có mặt của proanthocyanin làm phản ứng xuất hiện kết tủa đỏ.
Tannin [61]
Gelatin muối Thử trong ống nghiệm: NaCl (5g), gelatin ( 0.5g) hòa tan trong 100 mL nước cất. Phản ứng dương tính có tanin khi xuất hiện trầm hiện màu vàng nhạt, để lâu hóa thành nâu
Thử trong ống nghiệm Formol 36% ( 20mL) + 10mL HCl đậm đặc. Phản ứng dương tính có tannin khi xuất hiện trầm hiện màu đỏ.
28
Acid hữu cơ [63]
Na2CO3 Mẫu cao được hòa tan hoàn tan trong dung dịch cồn.
Cho một ít tinh thể Na2CO3 vào 10mL hỗn hợp. Sự
có mặt của acid hữu cơ làm cho bọt khí bay lên từ phản ứng.
Chất béo [63]
Giấy lọc Cao được hòa tan một phần trong ether, cho lượng mẫu thấm đều trên giấy lọc, bay hơi hết ether để lại vết mờ trên giấy mỏng, chứng minh trong mẫu cao có chứa chất béo.
2.3.6Hoạt tính gây độc tế bào
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ
(National Cancer Institute - NCI) xác nhận là một trong những phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung
thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks [64].
Phép thử này xác định tổng hàm lượng protein có được thông qua việc đo mật độ quang (OD). Thành phần protein trong tế bào được nhuộm với sulforhodamine B (SRB). Máy đo được giá trị OD càng lớn chứng tỏ có nhiểu đơn vị protein trong tế bào gắn với SRB. Cụ thể, phương pháp được tiến hành như hình 2.7 sau:
29
Hình 2.7 Sơ đồ quy trình xác định khả năng gây độc tế bào
Thuyết minh quy trình
- Hóa chất: L-glutamine, sodium bicarbonate, glucose, HEPES (4-(2- hydroxyethyl)- 1-piperazineethanesulfonic acid), sodium pyruvate, fetal bovine serum, sulforhodamine B, DMSO 10%, trichloroacetic acid, 5% acetic acid, tris(hydroxymethyl)aminomethane (THAM).
- Mẫu thử: Mẫu cao có hoạt tính mạnh nhất trong 21 mẫu cao nghiên cứu - Dòng tế bào thử nghiệm: Dòng tế bào Hep-G2 (ung thư gan)
- Tế bào Hep-G2 được nuôi cấy ở 37o C và 5% CO2 trong môi trường nuôi cấy EMEM (Eagle’s Minimal Essential Medium) với thành phần kèm theo gồm 2mM L-
10µL mẫu thử
Cho vào khay giếng
Thêm TCA
Nhuộm SRB 10mM
Thêm THAM
Đo quang tại 515nm Thêm tế bào
Ủ 30 phút
Ủ 1h Nuôi cấy tế bào
30
glutamine, HEPES 20 mM, và amphotericin B 0.025 mg/mL, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum FBS (Gibco), pencillin G 100 IU/mL và streptomycin 100 mg/mL. Tế bào
được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37o C,
5% CO2.
- Mẫu cao (10 µL) pha trong DMSO 10% (trong nước cất vô trùng) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 100 µg/mL. Chất thử có hoạt tính
được xác định IC50 từ các nồng độ 100, 20, 4, 0.8 và 0.16 µg/mL. Mỗi nồng độ của mẫu
thử được chuẩn bị thành 3 giếng.
- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 µL môi trường)