Kết quả định tính thành phần hoá học của hạt mỡ và hạt sáp được trình bày ở bảng 3.7. Dấu (+) cho kết quả dương tính với thuốc thử, có mặt nhóm chất tương ứng cần định tính; dấu (++) cho kết quả thử rất rõ, phản ứng xảy ra nhanh, cho màu sắc hoặc kết tủa ngay lập tức; dấu (-) cho kết quả âm tính.
Bảng 3. 7 Tóm tắt kết quả định danh thành phần hóa học cao N-H
Thành phần
Cách định danh
Kết quả dương
tính Hình ảnh minh họa Kết luận
Thuốc thử Mayer
Tạo kết tủa trắng
hoặc vàng nhạt ++
Thuốc thử
42
Saponin
Tính tạo bọt
Chiều cao cột bọt xuất hiện trong hai ống nghiệm Hai cột bọt không chênh lệch nhiều => Triterpenoid Phản ứng LieBermann- Burchard Nếu là dẫn chất steroid thì có màu lơ-xanh lá, còn dẫn chất triterpenoid thì có màu hồng đến tía. ++ Triterpenoid Anthocyanydin Dung dịch chuyển màu +
43
Proanthocyanin Kết tủa đỏ ++
Tanin
Gelatin muối Kết tủa vàng hóa
nâu +
Formol 36% Kết tủa trầm hiện
màu đỏ ++
Tinh dầu Có mùi thơm +
Acid hữu cơ Phản ứng sủi bọt khí -
44
Mẫu cao N-H được định danh và cho kết quả dương tính với sự có mặt của alkaloid,
saponin, anthocyanydin, proanthocyanin, tanin và tinh dầu.
Theo nghiên cứu của S.Idris và cộng sự (2009) [77], kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa học của chiết xuất methanol và ethyl acetate của hạt bơ Ba Tư cho thấy sự hiện của flavonoid, saponin, tannin, alkaloid cùng một số thành phần khác như cacbohydrate, steroid và terpenoid. Từ nghiên cứu khác của Aprilita Rinayanti (2013) [78] đã cho rằng, trong dịch chiết ethyl acetate của hạt bơ chứa saponin và tannin, trong khi dịch chiết từ methanol cho thấy sự hiện diện của saponin, tannin và flavonoid.
3.5 Hoạt tính kháng khuẩn
Bảng 3. 8Kết quả kháng khuẩn của mẫu cao N-H (Phụ lục 7 )
Vi sinh vật thử nghiệm Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
Staphylococcus aureus + - - - - Pseudomonas aeruginosa - - - - - Nồng độ (µg/mL) 100.00 50.00 25.00 12.50 6.25 Salmonella typhi - - - - - Bacillus cereus - - - - - Nồng độ (µg/mL) 1000 500 250 100 50 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kết quả cho thấy mẫu cao N-H cho kết quả dương tính với khả năng kháng khuẩn
Staphylococcus aureus ở nồng độ 100 µg/mL. Tuy nhiên đối với 3 chủng vi khuẩn còn lại, khả năng kháng khuẩn chưa thể hiện ở các nồng độ khảo sát. Sự khác biệt kết quả này có thể là do môi trường tạo nên các cao trích nồng độ khác nhau, chưa đảm bảo được khả năng chính xác tuyệt đối. Mặc khác, phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch dùng kết quả đo đường kính vòng vô khuẩn từ đơn vị mm có thể dẫn đến sai số rất nhỏ trong quá trình thực nghiệm.
45
3.6 Hoạt tính gây độc tế bào
Bảng 3. 9 Phần trăm gây độc tế bào ung thư Hep-G2 mẫu cao N-H và mẫu đối chiếu
Lần đo Mẫu 100 µg/mL Camptothecin 0.07 µg/mL 1 30.84 52.02 2 38.69 50.25 3 40.28 51.76 Trung bình 36.61±2.92 51.34±0.55
Từ bảng 3.9, có thể chứng minh được rằng, mẫu cao N-H vẫn có khả năng gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2. So với mẫu đối chiếu là camptothecin thì khả năng gây độc vẫn còn thấp. Cụ thể là tại nồng độ 100 µg/mL mẫu cao N-H gây ức chế tế bào ung thư gan với 36.61% trong khi mẫu camptothecin 0.07 µg/mL đạt 51.3%. Tuy nhiên, mặc dù giá trị
IC50 cụ thể chưa được xác đinh nhưng cần phải nhận đinh rằng, mẫu cao N-H vẫn có khả
năng gây độc tế bào ung thư gan ở mức chấp nhận.
Theo nghiên cứu của nhóm tác giả N.D.Nhứt và cộng sự (2008) [79] khảo sát hoạt tính gây độc ung thư bằng fucoion từ rong nâu cho thấy, các cao phân đoạn thứ 20 và 25 có khả năng ức chế 26.6% và 26.2% tế bào ung thư, cho kết quả dương tính trong khi phân đoạn 5, 10, 15 cho kết quả âm tính. Bên cạnh đó, tác giả T.H.Dương cùng cộng sự của mình đã nghiên cứu một số hợp chất từ rễ cây xáo tam phân (2016) [80] cũng cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư gan với tỉ kệ ức chế từ 16.11-71.78% đối với hợp chất coumarin. Hoạt tính ức chế tế bào ung thư của một số loài trong chi cơm nguội, được tác giả T.A.Viên và cộng sự (2016) xác định [81], tuy khả năng ức chế ở mức cao hơn 50% nhưng giá trị
IC50 cũng chỉ đạt ở mức tương đối. Cụ thể, trong dung môi methanol các mẫu thử có IC50
đạt 74.3 μg/mL, 55.84 μg/mL và có mẫu vẫn không xác định được IC50.
Trên thế giới, cũng đã có rất nhiều công trình nghiên cứu khả năng ức chế tế bào ung thư gan Hep-G2 từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau. P. macrocarpa là một cây thuốc được trồng ở Indonesia và Malaysia, được phân lập một số thành phần như lignan, alkaloid,
46
saponin cùng một số thành phần khác, loài này cũng được nghiên cứu hoạt tính gây độc tế
bào từ 59, 69 và 76% và tác dụng gây độc tế bào nhẹ đối với dòng Hep-G2 cho giá trị IC50
ở khoảng 30-60 µg/mL [82]. Trong một nghiên cứu trên đối tượng là cây chùm ngây (Moringa stenopetala) từ các bộ phận rễ, hạt và lá bằng các dung môi nước và ethanol, Negussu Mekonnen cũng cho thấy khả năng ức chế tế bào từ loài này cũng tương đối cao. Phần trăm ức chế của lá trong dung môi nước và ethanol là 25.4 và 74.3%, trong khi đó rễ và hạt chiết xuất từ ethanol lại cho giá trị 29.3 và 82.6% [83]. Một nghiên cứu khác trên hạt
giống cần sa cho thấy, đối với chiết xuất thô với dung môi methanol, giá trị IC50 là 104.7
µg/mL, hoạt tính rất thấp trong khi mẫu cao phân đoạn thứ ba có IC50 đạt cao hơn trong
việc ức chế tế bào Hep-G2 50.6 µg/mL [84]. Mặc dù vậy, nhưng hiện nay các công trình nghiên cứu về khả năng ức chế tế bào ung thư từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên ứng dụng cho ngành mỹ phẩm còn rất hạn chế, việc so sánh và tìm ra nguyên liệu tốt nhất và phù hợp nhất vẫn còn tồn tại.
Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào ung thư gan Hep-G2 là một thử nghiệm vô cùng quan trọng trong việc ứng dụng mẫu cao bơ này. Vì trong thực tế, các sản phẩm mỹ phẩm và dược phẩm đều có yêu cầu rất cao về an toàn sức khỏe người tiêu dùng, khả năng tiêu diệt tế bào ung thư gan ở mức độ khá cao 36.63% là chỉ tiêu hết sức cần thiết để đánh giá mẫu cao N-H có thể ứng dụng trong một số mỹ phẩm cũng như dược phẩm trị nám da mà vẫn an toàn cho người sử dụng.
47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Qua việc thu nhận các nguyên liệu từ phụ phẩm (hạt, hạt ngâm, vỏ và vỏ lụa) của một số loại bơ Việt Nam (bơ nước, bơ sáp, bơ booth và bơ 034), chúng tôi đã điều chế 21 mẫu cao trích (trong đó có 5 loại cao hỗn hợp). Những mẫu cao này được đánh giá khả năng ức
chế tyrosynase qua hai phương pháp khảo sát khả năng khử Cu2+ và khả năng ức chế
tyrosynase. Từ các kết quả cho thấy, tất cả các mẫu cao đều có khả năng ức chế tyrosynase, tuy nhiên, tùy thuộc vào từng bộ phận và từng loại bơ mà hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu.
Chúng tôi nhận thấy rằng, 3 trong số 21 mẫu cao được nghiên cứu có hoạt tính ức chế tyrosynase khá mạnh, đó là cao hạt bơ nước (N-H), hạt bơ booth (B-H) và hạt bơ booth
ngâm (B-HN). Cụ thể, khả năng khử Cu2+ được thể hiện qua các nồng độ 0.1 mg/mL, 0.5
mg/mL và 1.0 mg/mL cả ba mẫu cao này đều cho thấy giá trị độ hấp thu quang khá cao, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
điều đó chứng minh chúng có khả năng tạo phức với Cu2+ và ức chế hoạt động của ion này.
Cùng với đó, khi khảo sát khả năng ức chế tyrosynase, các mẫu N-H, B-H và B-HN cho thấy phần trăm ức chế cao ở các nồng độ 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 10 μg/ml và 5
μg/ml. Cụ thể giá trị IC50 của các mẫu cao này đạt 7.3 μg/ml đối với N-H, 9.3 μg/ml đối với
B-HN và 9.9 μg/ml đối với B-H trong khi acid kojic (đối chứng dương) có IC50 <5. Tuy
nhiên, mặc dù có khả năng ức chế tyrosynase nhưng hạt bơ 034 ngâm (O-HN), vỏ bơ 034
(O-V) và vỏ lụa bơ 034 (O-VL) có giá trị IC50 lại cao hơn 100 μg/ml.
Sau khi đã sàng lọc và so sánh kết quả, chúng tôi nhận thấy mẫu N-H là loại cao có hoạt tính mạnh nhất trong 21 mẫu cao. Một số thành phần alkaloid, saponin, anthocyanydin, proanthocyanin, tannin đã được định danh cũng đã giải thích phần nào về hoạt tính sinh học của mẫu cao này. Bên cạnh đó, N-H cũng thể hiện khả năng ức chế tế bào ung thư gan 36.61% tại nồng độ 100 µg/mL so với mẫu chứng camphtothecin 0.07µg/mL. Cùng với đó,
khả năng kháng khuẩn dòng Staphylococcus aureus cũng là cơ sở mở ra tiềm năng ứng
48
KIẾN NGHỊ
Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn trong nghiên cứu này vẫn còn hạn chế, cần xác định khả năng diệt khuẩn tại nhiều nồng độ khác nhau và nhiều chủng vi khuẩn khác nhau. Thử nghiệm các hoạt tính sinh khác nhằm đánh giá về mặt hoạt tính của các giống bơ Việt Nam, từ đó có những cơ sở khoa học cho việc tận dụng nguồn phụ phẩm hạt bơ sau này.
Phân lập và định danh các hợp chất từ các mẫu cao bơ điều chế từ các bộ phận, các giống bơ khác nhau tại Việt Nam.
Mở rộng khảo sát trên một số giống bơ khác như bơ Hass, Fuerte…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
49
tyrosine hydroxylation and melanin formation," vol. 157, no. 3, pp. 549-557, 1976.
[2] R. Yoruk and M. R. J. J. o. f. b. Marshall, "Physicochemical properties and function
of plant polyphenol oxidase: a review 1," vol. 27, no. 5, pp. 361-422, 2003.
[3] A. M. J. P. Mayer, "Polyphenol oxidases in plants and fungi: going places? A
review," vol. 67, no. 21, pp. 2318-2331, 2006.
[4] C. M. Kumar, U. Sathisha, S. Dharmesh, A. A. Rao, and S. A. J. B. Singh,
"Interaction of sesamol (3, 4-methylenedioxyphenol) with tyrosinase and its effect on melanin synthesis," vol. 93, no. 3, pp. 562-569, 2011.
[5] C. Queiroz, M. L. Mendes Lopes, E. Fialho, and V. L. J. F. r. i. Valente-Mesquita,
"Polyphenol oxidase: characteristics and mechanisms of browning control," vol. 24, no. 4, pp. 361-375, 2008.
[6] J. J. Nicolas, F. C. Richard‐Forget, P. M. Goupy, M. J. Amiot, S. Y. J. C. R. i. F. S.
Aubert, and Nutrition, "Enzymatic browning reactions in apple and apple products," vol. 34, no. 2, pp. 109-157, 1994.
[7] P. J. T. i. j. o. b. Riley and c. biology, "Melanin," vol. 29, no. 11, pp. 1235-1239,
1997.
[8] T. Kobayashi et al., "Tyrosinase related protein 1 (TRP1) functions as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis," vol. 13, no. 24, pp. 5818-5825, 1994.
[9] C. A. Ramsden, P. A. J. B. Riley, and m. chemistry, "Tyrosinase: The four oxidation (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
states of the active site and their relevance to enzymatic activation, oxidation and inactivation," vol. 22, no. 8, pp. 2388-2395, 2014.
[10] I. Kubo et al., "Molecular design of antibrowning agents," vol. 48, no. 4, pp. 1393- 1399, 2000.
[11] F. J. B. c. f. Badria, "A new type of tyrosinase inhibitors from natural products as potential treatments for hyperpigmentation," vol. 140, no. 4, pp. 267-271, 2001. [12] A. A. Gonçalves, A. R. M. J. L.-F. S. de Oliveira, and Technology, "Melanosis in
crustaceans: A review," vol. 65, pp. 791-799, 2016.
[13] A. OPOKU‐GYAMFUA and B. J. J. o. f. b. Simpson, "Purification and characterization of three polyphenol oxidase isozymes from lobster (Homarus
50
americanus)," vol. 16, no. 5, pp. 291-306, 1992.
[14] N. F. Haard and B. K. Simpson, Seafood enzymes: utilization and influence on
postharvest seafood quality. CRC Press, 2000.
[15] Y.-J. Kim, H. J. C. Uyama, and m. l. s. CMLS, "Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future," vol. 62, no. 15, pp. 1707-1723, 2005.
[16] B. J. P. Summers and C. Review, "A lightening tour of skin-brightening options," pp. 29-33, 2006.
[17] A. Sánchez-Ferrer, J. N. Rodríguez-López, F. García-Cánovas, F. J. B. e. B. A.-P. S. García-Carmona, and M. Enzymology, "Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism," vol. 1247, no. 1, pp. 1-11, 1995.
[18] K.-H. Wang et al., "Cosmetic applications of selected traditional Chinese herbal medicines," vol. 106, no. 3, pp. 353-359, 2006.
[19] M. A. Tremocoldi et al., "Exploration of avocado by-products as natural sources of
bioactive compounds," vol. 13, no. 2, p. e0192577, 2018.
[20] A. K. Cowan and B. N. Wolstenholme, "Avocado," in Encyclopedia of Food and
Health, 2016, pp. 294-300.
[21] P. F. Duarte, M. A. Chaves, C. D. Borges, and C. R. B. J. C. R. Mendonça, "Avocado: characteristics, health benefits and uses," vol. 46, no. 4, pp. 747-754, 2016.
[22] A. Cowan and B. Wolstenholme, "Avocado," 2016.
[23] H. Chen, P. L. Morrell, V. E. Ashworth, M. De La Cruz, and M. T. J. J. o. H. Clegg, "Tracing the geographic origins of major avocado cultivars," vol. 100, no. 1, pp. 56- 65, 2008.
[24] ABARES, "Agricultural commodity statistics 2011," ed: Department of Agriculture, Fisheries and Forestry Canberra, 2011.
[25] J. Serrano, R. Puupponen‐Pimiä, A. Dauer, A. M. Aura, F. J. M. n. Saura‐Calixto, and f. research, "Tannins: current knowledge of food sources, intake, bioavailability and biological effects," vol. 53, no. S2, pp. S310-S329, 2009.
51
[26] J.-G. Rodríguez-Carpena, D. Morcuende, M.-J. Andrade, P. Kylli, M. J. J. o. a. Estévez, and f. chemistry, "Avocado (Persea americana Mill.) phenolics, in vitro antioxidant and antimicrobial activities, and inhibition of lipid and protein oxidation in porcine patties," vol. 59, no. 10, pp. 5625-5635, 2011.
[27] A. F. Vinha, J. Moreira, and S. V. J. J. o. A. S. Barreira, "Physicochemical parameters, phytochemical composition and antioxidant activity of the algarvian avocado (Persea americana Mill.)," vol. 5, no. 12, p. 100, 2013.
[28] W. Wang, T. R. Bostic, and L. J. F. c. Gu, "Antioxidant capacities, procyanidins and pigments in avocados of different strains and cultivars," vol. 122, no. 4, pp. 1193- 1198, 2010.
[29] L. Nwaogu, C. Alisi, and O. J. B.-r. Ojiako, "Studies on the nutritional and phytochemical properties of Persea americana seed," vol. 6, no. 1, pp. 320-322, 2008.
[30] A. Egbuonu, I. Opara, C. Onyeabo, and N. J. J. N. H. F. E. Uchenna, "Proximate, Functional, Antinutrient and Antimicrobial Properties of Avocado Pear (Persea americana) Seeds," vol. 8, no. 1, p. 00260, 2018.
[31] J. Y. Talabi, O. A. Osukoya, O. Ajayi, G. J. A. J. o. P. S. Adegoke, and Research, "Nutritional and antinutritional compositions of processed Avocado (Persea americana Mill) seeds," vol. 6, no. 2, pp. 6-12, 2016.
[32] U. Arukwe et al., "Chemical composition of Persea americana leaf, fruit and seed," (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
vol. 11, no. 2, pp. 346-349, 2012.
[33] A. Kosińska et al., "Phenolic compound profiles and antioxidant capacity of Persea
americana Mill. peels and seeds of two varieties," vol. 60, no. 18, pp. 4613-4619, 2012.
[34] J. G. Figueroa, I. Borrás-Linares, J. Lozano-Sánchez, and A. J. F. r. i. Segura- Carretero, "Comprehensive characterization of phenolic and other polar compounds in the seed and seed coat of avocado by HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS," vol. 105, pp. 752-763, 2018.
52
activities of Persea americana (avocado) seed extracts," vol. 42, no. 2, pp. 110-113, 2009.
[36] J. G. Figueroa, I. Borrás-Linares, J. Lozano-Sánchez, and A. J. F. c. Segura- Carretero, "Comprehensive identification of bioactive compounds of avocado peel by liquid chromatography coupled to ultra-high-definition accurate-mass Q-TOF," vol. 245, pp. 707-716, 2018.
[37] A. López-Cobo, A. M. Gómez-Caravaca, F. Pasini, M. F. Caboni, A. Segura- Carretero, and A. J. L. Fernández-Gutiérrez, "HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS and HPLC-FLD-MS as valuable tools for the determination of phenolic and other polar compounds in the edible part and by-products of avocado," vol. 73, pp. 505-513, 2016.
[38] A. Jiménez-Arellanes et al., "Antiprotozoal and antimycobacterial activities of Persea americana seeds," vol. 13, no. 1, p. 109, 2013.
[39] R. Nwaoguikpe, W. Braide, C. J. J. o. M. Ujowundu, and Antimicrobials, "Biochemical composition and antimicrobial activities of the seed extracts of Avocado (Persea americana)," vol. 3, no. 7, pp. 184-190, 2011.
[40] A. N. F. Abubakar, S. S. Achmadi, and I. H. J. A. P. J. o. T. B. Suparto, "Triterpenoid of avocado (Persea americana) seed and its cytotoxic activity toward breast MCF-7 and liver HepG2 cancer cells," vol. 7, no. 5, pp. 397-400, 2017.
[41] M. Hidalgo, C. Sánchez-Moreno, and S. J. F. c. de Pascual-Teresa, "Flavonoid–