➢ Nguyên tắc
Trong môi trường pH = 6.8 tyrosynase chuyển hóa chất L- DOPA thành
DOPAchrom có màu đỏ cam hấp thụ bước sóng cực đại λmax = 475nm [53]. Mẫu cao trích
được cho vào dung dịch đệm gây ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, từ đó việc chuyển hóa L- DOPA sẽ giảm đi, cường độ hấp thụ màu cũng sẽ giảm [54]. Từ kết quả đo độ hấp thụ ở các nồng độ khác nhau mà chúng ta có thể đánh giá khả năng ức chế enzyme của các
mẫu cao trích thông qua phần trăm ức chế và giá trị IC50.
Hình 2.2 Cơ chế chuyển hóa L-DOPA dưới tác dụng tyrosynase
Đệm phosphat (0,1 M) pH = 6,8: đong 140 mL dung dịch Na2HPO4 0,2 M và 144
mL dung dịch NaH2PO4 0,5 M đổ vào becher 1000 mL. Thêm nước cất 1 lần và chỉnh đệm
đến pH = 6,8. Sau đó định mức trong fiol 1000 mL. Mẫu chuẩn bị nồng độ đầu là 1000μg/ mL
Chất nền L-DOPA (1,5 mM) cân 29,58 mg L-DOPA. Pha trong fiol 100 mL định
mức bằng đệm phosphate
Enzym tyrosynase from mushroom: 2687U/mg pha trong 83mL đệm phosphate.
22
Hình 2.3 Sơ đồ quy trình ức chế tyrosynase
➢ Thuyết minh quy trình
Mẫu được chuẩn bị với nồng độ 1000μg/ mL với đệm phosphate. Mẫu cao và lượng
đệm cần thiết sau khi thêm 100μL tyrosynase 300U.mL-1 thì được ủ trong tủ lạnh trong 30
phút. Sau đó, hỗn hợp được thêm vào 1000μL chất nền L-DOPA, lắc đều và đợi trong 7
phút rồi tiến hành đo quang tại bước sóng λmax= 475 nm.
Tổng thể tích cho mỗi dung dịch cần đo là 3000μL. Mẫu được sử dụng ở nồng độ làm việc lần lượt là 100, 50, 25, 10, 5μg/mL. Song song với việc chuẩn bị dung dịch mẫu thử là dung dịch mẫu trắng và mẫu đối chứng. Dung dịch mẫu trắng sẽ chứa lượng chất nền tương tự như mẫu đo, tuy nhiên lượng enzyme sẽ được thay bằng lượng đệm tương ứng. Mẫu đối chứng là dung dịch không chứa mẫu cao trích.
Mỗi mẫu nồng độ sẽ được đo 3 lần và lấy giá trị trung bình. Ứng với mỗi giá trị
trung bình, ta tính được phần trăm ức chế enzyme từng nồng độ, từ đó xác định được IC50
của mẫu và so sánh giữa các mẫu với nhau. Mẫu nhận giá trị IC50 càng bé chứng tỏ khả
V1 μL mẫu V2 μL đệm (pH=6.8)
V3 μL enzyme
V4 μL nền L-DOPA
Đo độ hấp thu quang tại 475nm Ủ 30 phút trong
tủ lạnh
23
năng ức chế enzyme càng hiệu quả.
Phần trăm ức chế được tính theo công thức: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
I% = 𝐴−𝐵
𝐴 × 100
Trong đó: A,B- Hoạt tính ức chế PPO từ mẫu control và mẫu cao
Cơ sở để đánh giá khả năng ức chế của những mẫu khảo sát được so sánh với chất đối chứng dương. Trong nghiên cứu này, acid kojic được chọn làm chất đối chứng dương, acid kojic là chất ức chế enzym tyrosinase mạnh.