➢ Nguyên tắc
Theo nghiên cứu của Mira và cộng sự (2002) [55] thì trong môi trường đệm pH=7.2-
7.4, phức đồng BCDS2Cu(I) được phát hiện màu đỏ cam tại bước sóng 480nm. Sự có mặt
của flavonoid trong thành phần mẫu cao bơ làm cho lượng Cu2+ chuyển hóa thành Cu+ (hình
2.4), và lúc đó phức chất BCDS2Cu(I) có màu đỏ cam được hình thành (hình 2.5). Phức
chất này chỉ tồn tại với ion Cu+ [56]. Vì vậy, ở nồng độ càng cao, mẫu cao trích sẽ có thành
phần flavonoid càng nhiều, phức chất tạo ra càng đậm màu.
Cơ chế : Theo nghiên cứu của M. Tereza Fernandez (1995) và David DA (2002) cùng cộng sự [57, 58] (hình 2.4, hình 2.5).
24
Hình 2.5 Cơ chế tạo phức đồng Chalate giai đoạn 2
➢ Sơ đồ quy trình
Hình 2.6 Sơ đồ khảo sát khả năng tạo phức với Cu2+
V1 μL mẫu V2 μL MOPS (pH=7.4)
V3 μL CuCl2
V4 μL BCDS
Đo độ hấp thu quang tại 480nm
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 2h
25 ➢ Thuyết minh quy trình
Chuẩn bị hóa chất
- Mẫu chuẩn Catechin chuẩn bị với nồng độ 350μM
- Dung dịch BCDS 3600μM
- Dung dịch CuCl2 800μM
- Đệm MOPS pH = 7.4
- Các mẫu cao chuẩn bị ở nồng độ chuẩn 10mg/mL
Thuyết minh quy trình
Quy trình khảo sát dựa vào cải tiến của Mira và cộng sự [55], với các dung dịch khảo
sát có nồng độ chuẩn như đã nêu. Tiến hành khảo sát thể tích các dung dịch để tìm ra V1,
V2, V3, V4 là các điều kiện thể tích tối ưu.
Với tổng dung dịch mỗi lần khảo sát là 3000μL, lần lượt khảo sát thể tích các dung
dịch CuCl2, BCDS, catechin (mẫu) bằng cách cố định các thể tích khác thông qua nồng độ
làm việc tương ứng. Ủ dung dịch sau 2h, thực hiện scan bước sóng từ 300 - 800nm, ứng
với vị trí có λmax là độ hấp thu quang của mẫu . Lựa chọn thể tích tối ưu là tại đó có độ hấp
thu quang cao nhất. Tiếp tục khảo sát các thể tích tiếp theo sau khi cố định thể tích đã khảo sát trước đó. Thể tích MOPS cần tối ưu là phần còn lại trong 3000μL.
Sau khi tối ưu hóa, thực hiện đo độ hấp thu quang trên các mẫu cao với các nồng độ làm việc là 1.0mg/mL, 0.5mg/mL, 0.1mg/mL. Cho hỗn hợp lượng mẫu và các thành phần khác theo kết quả đã tối ưu ủ sau 2h. Tiến hành đo độ hấp thu và so sánh kết quả.