a. Sắc ký lớp mỏng
3.2.9 Nghiờn cứu tỏc dụng bảo vệ gan của chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ chố Trung Du lỏ xanh – F 15 (in vivo) [ 6, 11,16 ]
+Nguyờn tắc:
Gõy tổn thương gan chuột thực nghiệm bằng cỏch tiờm i.p CCl4 với liều 4ml/kg. Sau đú cho chuột nhắt trắng uống mẫu thử theo cỏc liều dự định. Đỏnh giỏ tỏc dụng bảo vệ gan của cỏc chế phẩm cần thử qua việc khảo sỏt khả năng ức chế quỏ trỡnh peroxy hoỏ lipid (POL). Cỏc gốc tự do của oxy sinh ra trong gan chuột là những tỏc nhõn chớnh gõy ra phản ứng peroxy húa cỏc chất hữu cơ (chủ yếu là cỏc axit bộo chưa no ở màng tế bào); một trong những sản phẩm của quỏ trỡnh này là dialdehyt malonyl (DAM). Chất này (DAM) phản ứng với axit thiobarbituric tạo ra phức cú màu hồng bền ở λ =532 nm. Đo cường độ màu của phức (OD) cú thể biết lượng DAM sinh ra nhiều hay ớt. Hoạt tớnh chống oxy húa (HTCO) là tỷ lệ % lượng DAM giảm đi ở mẫu thử so với mẫu đối chứng. Thớ nghiệm được tiến hành với cỏc nồng độ Flavonoid khỏc nhau.
+Mụ hỡnh thớ nghiệm: thớ nghiệm được tiến hành trờn chuột và được chia thành 3 lụ - Lụ 1: lụ đối chứng sinh học (ĐCSH): chuột được nuụi và chăm súc bỡnh thường khụng dựng chế phẩm.
- Lụ 2: chuột được tiờm 0,2 ml dung dịch CCl4 10% trong dầu vừng, chăm súc bỡnh thường.
- Lụ 3: chuột vừa được tiờm 0,2 ml dung dịch CCl4 10% trong dầu vừng vừa được cho uống mẫu thử F15.
Sau 72 giờ tất cả cỏc chuột thớ nghiệm đều bị giết lấy gan để quan sỏt tổn thương thực thể của gan và xỏc định DAM theo phương phỏp C.G.Blagodorov:
+Hoỏ chất:Đệm Tris, FeSO4, axit ascorbic, TCA, axit thiobacbituric...
+Tiến hành: Mổ lấy gan chuột nhắt. Cõn chớnh xỏc 100mg gan chuột làm homogennat trong cối sứởđiều kiện 40 C với 5 ml đệm Tris 0,04 M, pH = 7,4 và 10 ml H2O. Ly tõm ở
600 vũng / phỳt trong 10 phỳt. Sau đú lấy 3 ml dịch ly tõm cho vào hỗn hợp gồm: 0,4 ml FeSO4 10-3 M; 0,4 ml dung dịch axit ascorbic 10-2 M. Ủ hỗn hợp ở 370 C trong 1 giờ, lấy hỗn hợp ủ ra. Thờm 2 ml dung dịch axit thiobacbituric 0,25%. Đun sụi cỏch thuỷ khoảng 15 phỳt, để nguội. Đo màu ở bước súng 532 nm.
+Lượng DAM được tớnh theo cụng thức:
C = D/ ε . l
Trong đú:
C: số mol DAM D: mật độ quang học
l: chiều dày cuvet ε: hệ số tắt mol = 1,56.10-5 M cm-1