a. Sắc ký lớp mỏng
3.2.7. Nghiờn cứu tỏc dụng độc tế bào invitro của cỏc chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ cỏc mẫu lỏ chố khỏc nhau [14, 27 ].
từ cỏc mẫu lỏ chố khỏc nhau [14, 27 ].
*Nguyờn vật liệu thớ nghiệm:
-Mẫu thử: cỏc chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ cỏc mẫu lỏ chố khỏc nhau
-Cỏc dũng tế bào ung thư: KB (Human epidermic carcinoma), HepG2 (Hepatocellular carcinoma); Lu (Human lung carcinoma), MCF -7 (Human breast carcinoma), S -180 (Sarcoma 180).
-Húa chất: MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) của hóng in vitrogen, DMSO của hóng sigma và cỏc húa chất khỏc
-Mỏy múc thiết bị: mỏy đọc ELISA của hóng Thermo Labsystems
* Phương phỏp:
+Nguyờn tắc:
Áp dụng phương phỏp MTT của Mosmann (1983) để đỏnh giỏ độc tớnh trờn tế bào. Nguyờn tắc của phương phỏp như sau: MTT là thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sút của tế bào. Tế bào được nuụi cấy trong một đĩa 96 giếng, đỏy bằng. Hợp chất MTT 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, cú màu vàng được thờm vào mỗi giếng và tế bào được ủ ở 37oC, 5% CO2. Màu vàng này bị biến đổi thành formazan tớm trong ty thể của những tế bào sống. Khả năng hấp thụ của dung dich cú màu này cú thểđược định lượng bằng mỏy quang phổ kếở bước song 540 – 600 nm. Sự biến
đổi màu chỉ xảy ra khi enzyme reductase trong ty thể là hoạt động, và do đú sự chuyển
đổi cú thể liờn quan trực tiếp đến số lượng tế bào sống sút. + Cỏch tiến hành:
-Nuụi cấy tế bào: Cỏc dũng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đỏnh thức và duy trỡ trong mụi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) cú bổ sung huyết thanh bờ tươi 10%, dung dịch khỏng sinh và khỏng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin
50 mg/L). Tế bào được nuụi cấy cho phỏt triển tới mức khoảng 70%, thay mụi trường sạch, tế bào này được dựng làm thớ nghiệm.
- Mẫu thớ nghiệm: Hũa mẫu thớ nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của cỏc mẫu là 2 mg/ml. Pha cỏc chế phẩm thử thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ: 0,5 àg/ml; 2 àg/ml; 8 àg/ml; 32 àg/ml; 128 àg/ml. Ellipticin được sử dụng làm chứng dương. Dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng õm.
- Quy trỡnh nuụi cấy:
.Cho khoảng 5000 tế bào vào 200 àl mụi trường nuụi cấy/ 1 giếng của đĩa nuụi cấy 96 giếng. Để 2 giếng trống làm chứng trắng (blank control).
.Cỏc tế bào được nuụi trong mụi trường ở 37oC và 5% CO2 cho phộp tế bào gắn vào
đỏy mỗi giếng của đĩa nuụi cấy. Giữ tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định.
.Sau 24 giờ nuụi cấy, thờm 10 àl thuốc thửở cỏc nồng độ khỏc nhau vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng. Lắc nhẹ đĩa nuụi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong mụi trường.
.Ủ đĩa nuụi cấy từ 48 giờ (37oC, 5% CO2)cho phộp thuốc phỏt huy tỏc dụng. Quan sỏt tế bào hàng ngày bằng kớnh hiển vi.
.Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml.
.Thờm 20 àl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuụi cấy. Lắc nhẹ cho MTT khuếch tỏn đều trong mụi trường nuụi cấy.
.Ủ 37oC trong 4 giờđể MTT được chuyển húa.
.Loại bỏ mụi trường trong cỏc giếng của đĩa nuụi cấy.
.Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển húa MTT) bằng 100 àl DMSO. Lắc kỹ để
formazan cú thể tan hoàn toàn.
.Đọc mật độ quang ở bước súng 540 nm trờn mỏy Spectrophotometter Genios TECAN. Mật độ quang sẽ phản ỏnh số lượng tế bào sống sút.
- % tế bào sống sau khi đó xử lý thuốc so với chứng trắng (tế bào khụng được xử lý bằng thuốc được gọi là % tế bào sống, được tớnh theo cụng thức như sau:
% tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý] x 100%/ [OD540 của tế bào khụng được xử lý thuốc]
-Cỏch tớnh giỏ trị IC50: Giỏ trị IC50 được tớnh bằng phõn tớch hồi quy khụng tuyến tớnh của đường cong đỏp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Graphpad Prism 5.0
3.2.8 Xỏc định độc tớnh cấp theo phương phỏp của A. Wallace Hayes [34 ] -Dựa theo nguyờn tắc và phương phỏp thửđộc tớnh cấp của Wallace Hayes.