a. Sắc ký lớp mỏng
3.2.5 Xỏc định hoạt độ peroxydaza trong mỏu theo E C Xavron [ 19]
*Nguyờn tắc: Một số Flavonoid cú ỏi lực cao đối với enzym peroxydaza tham gia vào phản ứng enzym với tư cỏch là một cơ chất và bị oxy hoỏ từ dạng khử (hydroquinon) thành dạng semiquinon hoặc quinon. Quinon và semiquinon sinh ra từ những Flavonoid tương ứng là những gốc tự do bền, cú khả năng “triệt tiờu” cỏc gốc tự do hoạt động cú hại của cơ thể. Trong phản ứng oxy hoỏ Indigocarmin hoạt độ enzym càng giảm thỡ số lượng
semiquinon hoặc quinon được tạo thành càng nhiều và điều đú thể hiện khả năng chống oxy hoỏ của Flavonoid. Trong phản ứng này, Flavonoid đúng vai trũ là cơ chất cạnh tranh
indigocarmin bởi H2O2 trong mụi trường axit yếu khi cú sự tham gia của enzym peroxydaza ở bước súng 610 nm cú thể tớnh được hoạt tớnh enzym ( và từđú sẽ tớnh được % ức chế hoạt động của enzym). Hoạt tớnh enzym peroxydaza ở mẫu đối chứng (khụng cú mẫu thử) là 100%, khi cú chất thử hoạt tớnh enzym sẽ thay đổi.
*Phương phỏp thử hoạt tớnh chống oxy húa (xỏc định hoạt độ peroxydaza mỏu người) +Nguyờn liệu thớ nghiệm:
- Mỏu tươi được chống đụng bằng ADC (Citrate dextrose adenine), pha loóng 500 lần bằng dung dịch NaCl 0,9%. Thớ nghiệm được tiến hành trờn nhúm mỏu O của người khỏe mạnh.
- Chất thử là cỏc chế phẩm Flavonoid chiết xuất từ cỏc mẫu lỏ chố khỏc nhau. Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho đạt được cỏc nồng độ là: 128 àg/ml; 32àg/ml; 8àg/ml; 2àg/ml; 0,5 àg/ml và nồng độ DMSO trong phản ứng khụng lớn hơn 1%.
+Phản ứng: 60 àl đệm axetat natri pH 4,7 0,1N 60 àl pha loóng 500 lần
60 àl H2O2 0,2N
20 àl Indigocarmin 0,001N
+ Để thời gian phản ứng 20 phỳt, sau đú đọc kết quả ở bước súng 610 nm, trờn mỏy quang phổ TECAN và xử lý số liệu bằng phần mềm raw data.