1.3.2.1. Enzym α–amylaza (EC.3.2.1.1.)
a.) Cấu trúc và tính chất của α–amylaza
Enzym α–amylaza là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000460.000.
Hiện nay, người ta đã biết rất rõ các chuỗi mạch acid-amin của 18 loại α- amylaza. Các α-amylaza từ các nguồn khác nhau thì có thành phần và trật tự sắp xếp các acid-amin khác nhau, song nhìn chung chúng đều khá giàu Tyrosin, Tryptophan. Các acid glutamid và aspactid chiếm ¼ tổng lượng acid-amin cấu thành phân tử enzym. Trong α-amylaza có rất ít methyonin và chỉ có khoảng 7 – 10 gốc Xystein.
α-amylaza là một enzym metaloenzym (enzym cơ kim). Các α-amylaza đều chứa từ 1430 phân tử gam Ca/mol, song không ít hơn 1 – 6 phân tử gam/mol. Khi tách hoàn toàn Ca khỏi phân tử enzym thì α-amylaza mất hết khả năng thủy phân cơ chất, vì Ca tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzym, duy trì cấu hình hoạt động của enzym, ngoài ra, Ca còn có tác dụng đảm bảo cho α-amylaza có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzym thủy phân protein.
Gần đây, các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid-amin, và về vùng kỵ nước cho thấy các chuỗi mạch acid-amin của tất cả các enzym α- amylaza đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau.
Cấu trúc α-amylaza gồm 3 vùng khác nhau:
-Vùng trung tâm A có kích thước lớn ở dạng thùng (α-β)8.
-Vùng B nằm giữa tờ giấy xếp β thứ 3 và xoắc ốc α tiếp sau cấu trúc (α-β)8. Vùng này được tạo nên từ ba tờ giấy xếp β đối song song và một vòng dài có cấu trúc ít trật tự. Vùng B được nối với vùng A bởi một cầu disunfua.
-Vùng C có cấu trúc tờ giấy xếp β và được liên kết với vùng A bởi một chuỗi đơn polypeptid. Tuỳ theo nguồn gốc enzym vùng này có thể mang thêm một mạch glucid.
Tâm hoạt động của α-amylaza nằm trong một rãnh có chiều dài khoảng 3nm, rãnh này nằm giữa vùng A ở đầu C của nó và vùng B. Tâm hoạt động thường được tạo nên bởi 5 đến 11 tâm phụ (A tới K) tùy theo nguồn gốc enzym.
Ở tâm hoạt động, cơ chất được giữ trong tư thế một hình thể bị uốn công nhờ các lực liên kết VanderWalls với một số acid-amin thơm cũng như các liên kết hydro giữa các mạch bên của các acid-amin có cực và cơ chất.
Tâm xúc tác của enzym có lẽ chỉ được giới hạn ở hai acid-amin có tính acid (aspartid, hay glutamid) nằm trong vùng gắn cơ chất.
Cơ chế thủy phân bắt đầu bằng sự làm yếu liên kết glucozit C1-O4 phải thủy phân, do kết quả của việc tạo nên phức enzym-cơ chất. Liên kết này lại một lần nữa bị yếu dưới tác dụng của một trong hai acid-amin acid tính đóng vai trò là chất cho proton tới O4. Và khi liên kết glucozit bị đứt tạo nên một ion oxycacbonium, ion này được ổn định bởi điện tích âm của một acid-amin acid tính khác. Sau cùng ion oxycacbonium tác dụng với một phân tử nước và hai oligosaccarit được tạo thành liền rời bỏ tâm hoạt động của enzym.
α-amylaza dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng. Protein của các α-amylaza có tính chất acid yếu và tính chất của globulin. Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,245,7.
α-amylaza bền nhiệt hơn so với các amylaza khác, đặc tính này liên quan tới hàm lượng Ca trong phân tử của nó.
Tất cả α-amylaza đều bị kìm hãm bởi kim loại nặng: Cu2+, Ag+, Hg2+,… pH và nhiệt độ tối ưu của α-amylaza phụ thuộc vào nguồn gốc enzym. Đáng chú ý là α-amylaza có nguồn gốc từ Baci, licheniformis có thể chịu được kiềm mạnh, và khả năng bền nhiệt tới 70480oC.
Bảng: Các tính chất của α-amylaza
Nguồn gốc enzym Trọng lượng phân tử pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu, oC
-Động vật: Tụy lợn -Thực vật: Malt 50.000 59.500 6,9 4,745,4 37 50455
-Vi sinh vật: B.licheniformis B.subtilis B.amylotiquefaciens B.stearothermophilus A.oryzae 22.500 47.000 49.000 49.000 52.600 5,049,0 5,346,4 5,9 5,446,1 5,546,9 76 50 65 70 40
b.) Cơ chế tác dụng của α–amylaza
Enzym α-amylaza thủy phân các liên kết α-1,4 trên nhiều mạch và tại nhiều vị trí của cùng một mạch, giải phóng ra các glucoza và các oligosaccarit có từ 247 đơn vị glucoza, trong đó có một glucoza khử tận cùng ở dạng α. Vì thế, người ta còn gọi enzym α-amylaza là enzym amylaza nội phân tử (endoamylaza).
α-amylaza không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với mức độ rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylaza là quá trình đa giai đoạn. Giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân, tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh. Sang giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra, trimaltoza không cho màu với Iod. Các chất này thủy phân rất chậm bởi α-amylaza cho tới di-, và monosaccarit.
-Dưới tác dụng của α-amylaza, amyloza bị phân giải khá nahnh thành oligosaccarit gồm 647 gốc glucoza, sau đó chúng lại được phân cắt tiếp tục nên các mạch polyglucoza cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetroza, maltotrioza và maltoza. Qua một thời gian tác dụng dài sản phẩm thủy phân của amyloza chứa 13% glucoza, 87% maltoza.
Theo một số tác giả, có hai cơ chế tác dụng lên amyloza ở trong dung dịch: cơ chế tấn công nhiều lần và cơ chế tấn công ưu tiên.
+Cơ chế tấn công nhiều lần: sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất là ngẫu nhiên, tất cả các liên kết đều có thể bị thủy phân. Sau khi thủy phân, chỉ có một phân tử được giải phóng khỏi enzym, còn phân tử kia được giữ lại trong lòng của enzym thì trượt dọc theo trung tâm hoạt động để chịu một sự thủy phân mới. Sau nhiều lần lặp lại quá trình này, chuỗi mạch được giải phóng nốt.
+Cơ chế thủy phân ưu tiên: sự tiếp xúc giữa enzym và cơ chất chỉ dẫn tới một lần thủy phân duy nhất, cả hai phân tử được giải phóng ra sau khi tiếp xúc. Và không phải mọi liên kết đều mẫn cảm như nhau đối với enzym.
-Tác dụng của α-amylaza lên amylopectin cũng xảy ra tương tự. Nhưng vì α-amylaza không phân cắt được liên kết α-1,6 glucozit ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu sự tác dụng lâu thì sản phẩm cuối
cùng ngoài các đường kể trên (72% maltoza, 19% glucoza) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltoza 8%.
Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylaza, tinh bột bị thủy phân thành maltotrioza, maltoza, glucoza và các α-dextrin phân tử thấp có chứa liên kết
α-1,6 với các liên kết α-1,4 kề bên thường bền với thủy phân. Tuy nhiên, thông thường α-amylaza chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iod và một ít maltoza. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylaza là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi amylaza này là amylaza dextrin hóa hay amylaza dịch hóa.
Sơ đồ: Biểu diễn phản ứng thuỷ phân tinh bột dưới tác dụng của α- amylaza
Tinh bột α-dextrin + maltoza + glucoza (đa phần) ( ít )
Hình: Cơ chế tác dụng của α-amylaza lên liên kết α-1,4 glucozit
1.3.2.2. Enzym β–amylaza (EC.3.2.1.2.)a.) Cấu trúc và tính chất của β–amylaza a.) Cấu trúc và tính chất của β–amylaza
β-amylaza chỉ phổ biến trong thế giới thực vật, đặc biệt có nhiều trong hạt nảy mầm. Những hiểu biết về β-amylaza còn rất hạn chế, chỉ có các enzym có nguồn gốc thực vật được biết đến nhiều nhất.
Khác với α-amylaza, β-amylaza nó rất bền khi không có Ca, bị kie6m2 hãm bởi Cu2+, Hg2+, ure6, iodoacetamidiol, ozon,…
pH tối ưu nằm trong khoảng 546, nhiệt độ tối ưu vào khoảng 50oC. Tuy nhiên, β-amylaza của vi khuẩn thường bền nhiệt hơn so với các β-amylaza có nguồn gốc thực vật.
Bảng: Các đặc tính của β-amylaza
Nguồn gốc enzym Trọng lượng phân tử pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu, oC
-Thực vật:
Đại mạch 56.000 5,2 -
α- +H2O
Lúa mì Đỗ tương Khoai lang -Vi sinh vật: B.cerus B.polymyxa B.megaterium 64.200 57.000 50.000 58.000 42.000 58.000 5,246,2 5,4 5,046,0 7,0 7,5 6,5 55 55 50455 40 40 40465
b.) Cơ chế tác dụng của β–amylaza
β-amylaza xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 của amyloza và amylopectin, phân cắt tuần tự từng gốc maltoza một từ đầu không khử của mạch. maltoza tạo thành có cấu hình β.
Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylaza khác với α-amylaza ở một số điểm:
-Trước hết là nó hầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành, mà lại thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột.
-β-amylaza phân giải 100% amyloza thành maltoza và chỉ phân giải độ khoảng 544 58 % amylopectin thành maltoza và β-dextrin. Quá trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng, tạo nên maltoza. Khi gặp liên kết α-1,4 đứng kế cận liên kết α-1,6 thì
β-amylaza ngừng tác dụng, phần saccarit còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucozit và được gọi là β-dextrin, nó cho màu tím đỏ với Iod.
-Các enzym β-amylaza tác dụng theo cơ chế tấn công bội, có nghĩa là enzym sẽ thủy phân lần lượt liên kết glucozit của cùng một chuỗi trước khi được rời ra trong môi trường.
Sơ đồ: Biểu diễn phản ứng thuỷ phân tinh bột dưới tác dụng của α- amylaza
Tinh bột β-dextrin + maltoza
(42446%) (58454%)
Hình: Cơ chế tác dụng của b-amylaza lên liên kết α-1,4 glucozit
β-amylaza +H2O
2 3 4
-amylaza 1.3.2.3. Enzym γ–amylaza (EC.3.2.1.3.)
a.) Cấu trúc và tính chất của γ–amylaza
γ-amylaza chủ yếu được tạo ra từ vi sinh vật, đặc biệt là từ nấm mốc kiểu Aspergillus. Penicillium và Rhizopus.
γ-amylaza từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử dao động từ 27.0004112.000, tùy thuộc vào nguồn gốc enzym.
Nói chung, γ-amylaza đều có chứa các gốc methyonin, tryptophan và một nữa gốc xytein. Tất cả các γ-amylaza đều là γ;ucoprotein, chứa 5420% glucid, trong đó chủ yếu là glucoza, maltoza, galactoza và glucoamin,
Tính chất của γ-amylaza phụ thuộc vào nguồn gốc của enzym. Hoạt động tối thích của enzym nằm trong khoảng pH từ 4,545,5 và nhiệt độ 404600C. Sự có mặt của các aligosaccarit trong môi trường có tác dụng ổn định enzym, ngược lại sự có mặt của ion Ca2+ kìm hãm chúng và làm biến tính chúng.
Bảng: Các đặc tính của γ-amylaza
Nguồn gốc enzym Trọng lượng phân tử pH tối ưu Nhiệt độ tối ưu, oC
-Vi sinh vật: A.niger I A.niger II A.oryzae I A.oryzae 90.000 112.000 76.000 38.000 4,545,0 4,545,0 4,5 4,5 - - 60 50
b.) Cơ chế tác dụng của γ–amylaza
γ-amylaza tách tuần tự và giải phóng ra β-D-glucoza bằng cách thủy phân lặp lại nhiều lần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử. Chúng cũng thủy phân được các liên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng mức độ rất chậm (chậm hơn từ 10430 lần). Tốc độ thủy phân cũng phụ thuộc vào bản chất các liên kết kề cận với liên kết glucozit được thủy phân, cũng như kích thước và cầu trúc của cơ chất bị thủy phân. Nhất là các α-glucan mạch dài thì bị thủy phân nhanh hơn là các maltodextrin và các oligosaccarit.
Đây là enzym duy nhất có khả năng chuyển hóa tinh bột hoàn toàn thành glucoza. Tuy nhiên khi nồng độ β-glucoza trong môi trường tăng lên do sự thủy phân các mạch α-glucan thì các γ-amylaza có thể xúc tác ngưng tụ nhiều đơn vị glucoza để tạo ra maltoza, và isomaltoza.
Hình: Cơ chế tác dụng của γ-amylaza lên liên kết α-1,4 và α-1,6 glucozit
1 2 34 -amylaza -amylaza O CH2OH HOOH OH OH