32
Kích thước hạt được xác định bằng phương pháp tán xạ lase. Nguyên lý chung của phương pháp là khi chiếu chùm tia lase vào các hạt có kích thước khác nhau sẽ thu được mức độ tán xạ ánh sáng khác nhau. Bằng cách đo cường độ ánh sáng tán xạ có thể xác định được kích thước tiểu phân.
Sử sụng máy phân tích kích thước hạt Zetasizer Nano ZS90 đo kích thước trong khoảng 0,01 – 10000nm. Trước khi đo cần tiến hành pha loãng chế phẩm nhiều lần bằng nước cất đã lọc qua màng 0,2 μm để tránh hiện tượng đa tán xạ. Mẫu pha loãng được đo ở điều kiện hệ số khúc xạ ánh sáng bằng 1,3310; nhiệt độ đo 25oC. Phân bố kích thước tiểu phân cũng được dùng để đánh giá hệ tiểu phân nano lipid rắn thông qua chỉ số đa phân tán (PDI), chỉ số PDI càng gần bằng 0 thì các tiểu phân trong hệ có kích thước càng đồng đều.
2.3.4.2. Xác định hàm lượng dược chất, hiệu suất mang dược chất trong hệ tiểu phân nano lipid rắn
Hiệu suất mang dược chất được xác định gián tiếp thông qua việc định lượng dược chất tự do và lượng dược chất tổng có trong hệ.
Xác định lượng dược chất tự do
+ Mẫu chuẩn: tiến hành tương tự ở mục 2.3.3.2. Từ dung dịch gốc A (nồng độ 2000 μg/ml trong nước tinh khiết), pha loãng bằng nước tinh khiết đến nồng độ 100 μg/ml, lọc qua màng 0,45 μm.
+ Mẫu thử: hút khoảng 2 ml hệ tiểu phân nano lipid rắn bào chế được, cho vào phần thân của ống siêu ly tâm Milipore®
UFC801008 Amicon®, tiến hành ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 250C, trong khoảng 60 phút. Hút lấy phần dịch trong ở đáy ống, pha loãng bằng nước tinh khiết đến nồng độ thích hợp trong khoảng tuyến tính, lọc qua màng 0,45 μm.
+ Tiến hành chạy sắc ký mẫu thử và mẫu chuẩn với các thông số được mô tả ở mục 2.3.3.2. Dựa trên diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn để tính ra lượng dược chất tự do có trong hệ tiểu phân bào chế (mg/ml).
33
+ Mẫu chuẩn: tiến hành tương tự ở mục 2.3.3.2. Từ dung dịch gốc A (nồng độ 2000 μg/ml trong nước tinh khiết), pha loãng bằng ethanol đến nồng độ 100 μg/ml, lọc qua màng 0,45 μm.
+ Mẫu thử: hút chính xác 2 ml hệ tiểu phân nano lipid rắn bào chế được cho vào bình định mức 50 ml, đun cách thủy ở 600C trong 30 phút để hệ được phá vỡ cấu trúc hoàn toàn. Thêm khoảng 40 ml ethanol, tiếp tục duy trì nhiệt độ trên trong 30 phút để hòa tan các thành phần của hệ, làm nguội về nhiệt độ phòng, bổ sung vừa đủ 50 ml ethanol, làm lạnh về 40C để các lipid hóa rắn lại. Tiến hành ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy phần dịch trong, lọc qua màng 0,45 μm.
+ Tiến hành chạy sắc ký mẫu thử và mẫu chuẩn với các thông số được mô tả ở mục 2.3.3.2. Dựa trên diện tích pic của mẫu thử và mẫu chuẩn để tính ra lượng dược chất toàn phần có trong hệ tiểu phân bào chế (mg/ml).
Công thức tính hàm lượng dược chất có trong hệ (tỷ lệ tìm lại)
HL (%) = mtotal .100% mlthuyet
Trong đó HL: hàm lượng dược chất có trong hệ so với lý thuyết (%) mtotal: lượng dược chất toàn phần (mg/ml)
mlthuyet: lượng dược chất lý thuyết trong công thức (mg/ml) Công thức tính hiệu suất mang dược chất (EE)
EE (%) =
mtotal - mfree
.100% mtotal
Trong đó EE: hiệu suất mang dược chất (%)
mtotal: lượng dược chất toàn phần (mg/ml) mfree: lượng dược chất tự do (mg/ml)
2.3.4.3. Đánh giá lượng dược chất thấm qua da
Lượng dược chất thấm qua da của các công thức hệ tiểu phân nano lipid rắn được đánh giá qua lượng dược chất thấm qua màng da lưng chuột nhắt (đối với các công thức tốt nhất).
34
Qua tham khảo tài liệu [8], [11], [38], [47] lượng diclofenac natri thấm qua da được tiến hành đánh giá ở các điều kiện cụ thể sau:
Điều kiện thử:
+ Thiết bị: hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research
+ Màng khuếch tán: Màng da lưng chuột nhắt đực (khối lượng từ 20 – 25 g), đã được loại lông, tách riêng và được làm sạch lớp mỡ dưới vùng da bằng dao và kéo phẫu thuật, tiến hành rửa bằng dung dịch nước muối sinh lý và bảo quản ở nhiệt độ -10oC. Trước khi sử dụng, màng da lưng được hoạt hóa bằng môi trường thử giải phóng trong vòng 30 phút.
+ Môi trường khuếch tán: dung dịch salin đệm phosphat pH 7,4 (gồm có: 8,01 g NaCl, 0,2 g KCl, 3,58 g Na2HPO4.12H2O, 0,27 g KH2PO4, nước cất vừa đủ 1000 ml) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Thể tích môi trường: 7 ml, diện tích thử 1,767 cm2 + Nhiệt độ thử: 37oC
+ Tốc độ khuấy: 400 vòng/phút
+ Khối lượng mẫu thử: tương đương 2 mg dược chất. Cách tiến hành:
Tại thời điểm t=0, cho lượng thích hợp hệ tiểu phân nano lipid rắn vào ngăn cho. Lấy mẫu ở các thời điểm t = 1, 2, 4, 6 và 8 và 24 giờ. Thể tích mỗi lần lấy là 1 ml. Quá trình lấy mẫu đồng thời cũng là quá trình thêm môi trường giải phóng vào ngăn nhận với thể tích bằng thể tích môi trường đã lấy ra. Xác định lượng dược chất thấm qua màng (da) bằng phương pháp HPLC, so sánh với mẫu chuẩn (nồng độ 100 μg/ml). Từ đó xây dựng đồ thị thể hiện lượng dược chất thấm qua da của dược chất trong hệ theo thời gian.
Công thức tính: 𝑚𝑖 = 1 1,767 × 𝐶𝐶 𝑆𝐶 × (𝑆𝑖 × 7 + 𝑆𝑖−1 i−1 𝑡=0 )
35
Si, Si-1 (i=0,1,2,3,4,5,6) lần lượt là diện tích pic mẫu thử tại thời điểm thứ i và i-1
CC , SC lần lượt là nồng độ và diện tích mẫu chuẩn 1,767 là diện tích màng thử khuếch tán (cm2
).
2.3.4.4. Đánh giá khả năng lưu giữ dược chất trên da sau 24 giờ
Qua tham khảo tài liệu [8], khả năng lưu giữ dược chất trên da sau 24 giờ được xác định như sau:
Cách tiến hành:
Sau khi kết thúc quá trình đánh giá lượng dược chất thấm qua da chuột trên hệ thống thử giải phóng qua màng Hanson Research, phần da chuột đóng vai trò màng khuếch tán (ngăn giữa ngăn cho và ngăn nhận) được lấy ra, rửa sạch bằng dung dịch salin đệm phosphats pH 7,4 (3 lần), dùng kéo cắt nhỏ miếng da cho vào bình định mức 10 ml, thêm vào khoảng 5 ml ethanol, tiến hành siêu âm 2 lần, mỗi lần 30 phút. Bổ sung vừa đủ 10 ml ethanol. Tiến hành ly tâm dịch sau siêu âm ở tốc độ 8000 vòng/phút trong 10 phút, hút lấy phần dịch trong, lọc qua màng 0,45 μm. Tiến hành chạy sắc ký, dựa vào kết quả diện tích pic mẫu thử và mẫu chuẩn để tính được lượng dược chất lưu giữ trên da.
Công thức tính:
𝑚𝑙ư𝑢 𝑔𝑖ữ = 1
1,767 ×
𝐶𝐶
𝑆𝐶 × 10 × 𝑆𝑙ư𝑢 𝑔𝑖ữ
Trong đó mlưu giữ là lượng thuốc lưu giữ trên da sau 24 giờ (μg/cm2)
SC Slưu giữ, CC lần lượt là diện tích pic mẫu chuẩn, diện tích mẫu thử và nồng độ mẫu chuẩn
1,767 là diện tích màng thử khuếch tán (cm2).
10 là hệ số pha loãng