Bào chế gel chứa tiểu phân nano lipid rắn có nhiều ưu điểm hơn các loại gel thông thường về khả năng thấm, khả năng lưu giữ cũng như khả năng chống viêm kéo dài. Để so sánh mức độ chống viêm, các công thức G1, G2, G3 với các thành phần như trong bảng 3.20. được tiến hành đánh giá tác dụng chống viêm theo mô hình gây phù chân chuột được trình bày ở mục 2.3.7. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.22 và hình 3.19.
64
Bảng 3.22. Độ phù và phần trăm ức chế phù chân chuột ở các thời điểm so với thời điểm ban đầu trong thử nghiệm đánh giá khả năng chống viêm (n=6) Thời điểm
Mẫu 1 giờ 3 giờ 5 giờ 7 giờ 24 giờ
Volaren Emulgel X% 4,51±1,30 14,46±0,64b 14,22±3,22a 12,82±3,73a 7,69±1,88 I% 25,11 40,76 67,69 50,11 35,82 G1 X% 3,51±1,28 10,10±1,63 b 12,23±1,75b 9,99±1,47b 6,06±1,09a I% 41,72 58,61 72,21 61,13 49,41 G2 X% 3,24±1,15 9,52±3,42 b 14,73±3,15a 11,87±2,26b 5,79±1,01a I% 46,27 60,99 66,53 53,83 51,65 G3 X% 4,50±0,90 12,50±2,10 b 17,20±2,69a 14,03±2,23a 9,11±1,67 I% 25,32 48,79 60,91 45,42 23,95 Chứng X% 6,03±2,81 24,41±1,72 43,99±8,95 25,70±3,15 11,98±2,44 Ghi chú Các giá trị được biểu diễn dưới dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn
a thời điểm có sự khác nhau giữa nhóm thử với nhóm chứng có ý nghĩa thống kê với mức giá trị p<0,05
b
thời điểm có sự khác nhau giữa nhóm thử với nhóm chứng có ý nghĩa thống kê với mức giá trị p<0,01
Hình 3.19. Đồ thị thể hiện phần trăm ức chế phù tại các thời điểm của các nhóm thử (G1, G2, G3 và Voltaren Emulgel) so với nhóm chứng trong thử nghiệm
đánh giá khả năng chống viêm 0 20 40 60 80 100 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 % Ức chế phù (% )
Thời điểm (giờ)
Vol G1 G2 G3
65 Nhận xét:
Trong thử nghiệm chống viêm, nghiên cứu tiến hành với n=8 con ở mỗi nhóm, tuy nhiên mỗi nhóm đều có ít nhất 2 con thể hiện độ phù ở một số thời điểm thấp hơn thời điểm ban đầu, dẫn đến độ phù trung bình nhóm chứng placebo thấp hơn độ phù trung bình các nhóm còn lại. Do vậy, để xử lý thống kê so sánh các nhóm thử với nhóm chứng placebo, tiến hành loại bỏ các kết quả bất thường (2 con/ nhóm), bộ số liệu được tiến hành xử lý bằng phần mềm SPSS cho kết quả như trong bảng 3.22
Về độ phù chân chuột của các nhóm thuốc, dựa vào kết quả ở bảng 3.22, cho thấy nhìn chung mức độ phù tăng mạnh ở các thời điểm 3, 5, 7 giờ, nhóm sử dụng thuốc Voltaren Emulgel cho độ phù cao nhất ở thời điểm 3 giờ và giảm dần ở các thời sau, ở nhóm chứng placebo và các nhóm thử, độ phù cao nhất tại thời điểm 5 giờ. Ở tất cả các nhóm, chỉ có thời điểm 3, 5, 7 là có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng (p<0,05), riêng tại thời điểm 24 giờ tác dụng chống viêm chỉ có nhóm G2 và G1 (có p<0,05 so với nhóm chứng placebo), nghĩa là các thời điểm đó các nhóm thử có ý nghĩa chống viêm so với nhóm chứng (p<0,05).
Về phần trăm ức chế phù, kết quả ở hình 3.22 cho thấy G1, G2 có xu hướng ức chế phù mạnh và duy trì tác dụng đến 24 giờ hơn Voltaren Emulgel và G3 (phần trăm ức chế phù tại thời điểm 24 giờ ở nhóm Voltaren Emulgel và các nhóm thử G1, G2, G3 lần lượt là 35,82%, 49,41%, 51,65% và 23,95%). Vậy, có thể kết luận hệ gel G1 và G2 có tác dụng chống viêm kéo dài đến 24 giờ, và tác dụng chống viêm tại thời điểm 24 giờ cao hơn Voltaren Emulgel.
66
Chƣơng 4: BÀN LUẬN 4.1. Về dƣợc chất
Diclofenac natri sử dụng qua đường dùng qua da đem lại nhiều ưu thế, thêm vào đó dạng bào chế gel chứa tiểu phân nano lipid rắn giúp cải thiện tính thấm dược chất qua da, tăng hiệu quả điều trị. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để phối hợp diclofenac natri vào hệ tiểu phân nano lipid rắn để có hiệu quả cao. Nghiên cứu cho kết quả độ tan của diclofenac natri trong nước khoảng 25 mg/ml (kết quả thể hiện ở
phụ lục 5) (nằm trong khoảng 10 - 33 mg/ml, thuộc nhóm chất ít tan nước, theo bảng phân loại độ tan theo phụ lục dược điển Mỹ [53]), do vậy việc bào chế dưới dạng nano lipid rắn sẽ gặp cản trở, đặc biệt là hiệu suất mang thuốc thấp. Các biện pháp cải thiện hiệu suất mang thuốc theo các hướng: tăng tỷ lệ lipid – dược chất, sử dụng phối hợp với phospholipid và điều chỉnh pH pha ngoại. Kết quả đã cải thiện được hiệu suất mang thuốc lên trên 60%.
4.2. Về bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn
4.2.1. Về lipid
Hệ tiểu phân nano lipid rắn khi sử dụng các chất tạo cốt lipid khác nhau cho các hệ có các đặc tính khác nhau, do mỗi lipid có một cấu trúc, thành phần và tính chất vật lý khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dụng các sáp (alcol cetylic, alcol cetostearylic) cho hệ có kích thước tiểu phân vào khoảng 100 – 250 nm, PDI khá thấp (<0,200), tuy nhiên, hiệu suất mang dược chất lại không cao (khoảng 44%); trong khi đó, sử dụng các loại glycerid (GMS, Precirol) cho kích thước nhỏ hơn 100 nm và hiệu suất mang thuốc cao (>50%). Có sự khác nhau giữa 2 loại này là do các trạng thái kết tinh khác nhau, GMS và Precirol có trạng thái kết tinh hỗn loạn, trật tự kém nên dẫn đến có nhiều lỗ hổng để chứa các phân tử dược chất, từ đó làm hiệu suất mang thuốc cao hơn, trái lại, các sáp cho trạng thái kết tinh trật tự cao dẫn đến giảm hiệu suất mang thuốc. Kết quả này khá tương đồng với nghiên cứu của Jenning V. và cộng sự [19].
Nghiên cứu cho thấy GMS là lipid tốt nhất trong các lipid khảo sát, cân bằng được các yếu tố về kích thước tiểu phân, PDI và hiệu suất mang thuốc. GMS với
67
nhiệt độ nóng chảy không quá cao (55 – 600C), không những đóng vai trò là lipid tạo cốt, mà còn có khả năng nhũ hóa với giá trị HLB 3,8 [41]. Trong các nghiên cứu về hệ tiểu phân nano chứa diclofenac natri, GMS cũng được lựa chọn làm lipid tạo cốt như trong các trong các nghiên cứu của Liu D. và cộng sự [25], [26], [27], hay trong nghiên cứu của Gaur và cộng sự [17].
Khi tăng tỷ lệ lipid – dược chất, hệ tiểu phân nano lipid rắn tạo được có xu hướng kích thước tiểu phân tăng và hiệu suất mang dược chất tăng. Tỷ lệ lipid – dược chất càng cao càng giúp cho không gian hỗn loạn trong cốt lipid càng tăng lên, từ đó dược chất càng có nhiều vị trí để bám giữ trong cốt lipid [18]. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Liu D. và cộng sự, theo đó, khi giữ nguyên lượng lipid và tăng dần lượng dược chất, kích thước tiểu phân có xu hướng tăng, PDI tăng và hiệu suất mang thuốc giảm [27]. Cũng cùng xu hướng trên, khi giữ nguyên tỷ lệ dược chất – lipid và giảm thể tích pha ngoại (tăng nồng độ lipid trong hệ), hệ có xu hướng tăng kích thước tiểu phân, tăng hiệu suất mang thuốc. Điều này là do khi nồng độ lipid tăng dẫn đến độ nhớt của hệ tăng, khi sử dụng cùng một năng lượng siêu âm, khả năng phân chia các giọt nhũ tương dầu trong nước sẽ kém làm kích thước các giọt tiểu phân tăng lên và kích thước của các tiểu phân nano lipid rắn tạo thành cũng tăng lên. Đồng thời, khi tăng nồng độ lipid, trạng thái kết tinh của chúng sẽ càng kém trật tự, làm tăng khả năng giữ dược chất trong tiểu phân, kéo theo hiệu suất mang dược chất tăng lên đáng kể [18]. Xu hướng ảnh hưởng của nồng độ lipid trong hệ cũng giống với kết quả nghiên cứu trước đó [17].
4.2.2. Về chất diện hoạt
Trong quá trình bào chế, quá trình phân tán ban đầu cần chứa lượng chất diện hoạt dư thừa để bao phủ nhanh chóng bề mặt tiểu phân mới hình thành trong quá trình đồng nhất. Nếu lượng chất diện hoạt không đủ sẽ dẫn đến kết tụ các bề mặt lipid chưa được bao phủ. Thời gian cần để phân phối lại chất diện hoạt giữa các phân tử bề mặt mới và các micell là khác nhau khi sử dụng các chất diện hoạt khác nhau. Thông thường các chất diện hoạt có khối lượng thấp sẽ cần ít thời gian hơn để phân bố lại [57].
68
Nghiên cứu chỉ ra các loại chất diện hoạt khác nhau cho sự khác nhau đáng kể về đặc tính của hệ, cụ thể PVA cho hệ kém nhất (kích thước tiểu phân và PDI lớn, hiệu suất mang thấp), Tween cho đặc tính hệ tốt và hiệu suất mang cao nhất. Kết quả nghiên cứu khá tương đồng và phù hợp với lý thuyết cũng như một số nghiên cứu trước đó. Về bản chất PVA chứa một lượng lớn nhóm hydroxyl có thể tạo liên kết hydro giữa các phân tử, làm tăng độ nhớt pha nước, làm tăng kích thước tiểu phân. Tween 80 và cremophor là chất diện hoạt không ion hóa hay được sử dụng trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn. Lanolin PEG-75 là dẫn xuất của polyethylen glycol, vai trò là chất nhũ hóa, được dùng trong các mỹ phẩm hay các dạng bào chế qua da, sử dụng trong nghiên cứu này với mục đích đánh giá tác dụng của nó trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn, chưa từng được sử dụng trong các nghiên cứu trước đó. Nghiên cứu cho thấy lanolin PEG-75 cho kết quả tốt hơn PVA, cremophor và chỉ kém Tween 80. Nồng độ chất diện hoạt ảnh hưởng lớn đến kích thước và PDI, tăng nồng độ chất diện hoạt giúp giảm sức căng bề mặt, giảm kết tụ phân tử trong quá trình đồng nhất, dẫn đến giảm kích thước tiểu phân. Nghiên cứu cũng cho kết quả có xu hướng phù hợp với nhận định trên, đồng thời, nồng độ chất diện hoạt tăng từ 0 đến 2% cho hiệu suất mang thuốc tăng mạnh, và có xu hướng tăng nhẹ khi nồng độ tăng đến 3%. Tương tự, nghiên cứu của Liu D. và cộng sự cũng cho kết quả sử dụng Tween 80 cho hiệu suất mang thuốc tốt hơn cremophor và PVA [25]. Nghiên cứu của Das S. cho kết quả sử dụng cremophor cho kích thước nhỏ hơn, PDI cao hơn và sử dụng Tween cho hiệu suất mang thuốc cao hơn. Sử dụng nồng độ Tween 80 tăng từ 0,5% đến 3% cho kích thước giảm từ 392,1 xuống 107,6, PDI giảm khi nồng độ tăng lên đến 2,5%, tuy nhiên, PDI tăng khi tiếp tục tăng nồng độ lên 3%, hiệu suất mang thuốc tăng theo chiều tăng của nồng độ chất diện hoạt [14]. Tuy nhiên, kết quả ngược lại trong nghiên cứu của Khalil R. M., khi nồng độ chất diện hoạt tăng lại cho hiệu suất mang thuốc giảm và sử dụng cremophor RH40 cho kết quả tốt hơn khi dùng Tween 80 [21].
69
Phospholipon P90G là dẫn chất của lecithin, có nồng độ phosphatidyl cholin dưới 90%, giá trị HLB bằng 10, là thành phần trong pha dầu trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn.
Năng lượng bề mặt là thước đo cho hiệu quả phân tán. Khi tăng nồng độ phospholipid lên làm tăng diện tích tiếp xúc bề mặt hai pha dẫn đến giảm kích thước tiểu phân. Tuy nhiên, khi đạt nồng độ tới hạn, nếu tiếp tục tăng lượng phospholipid cũng không làm giảm kích thước, mặt khác, hình thành các cấu trúc tiểu phân khác với tiểu phân nano lipid rắn. Với lượng lớn phospholipid, việc tương hợp hoàn toàn vào cốt lipid là khó xảy ra, cốt lipid chỉ có thể hợp nhất với một lượng phospholipid ở một giới hạn nhất định. Ở nồng độ cao, cấu tạo đa lớp của phospholipid có thể dễ dàng tạo thành các cấu trúc liposome. Ở nồng độ thích hợp, phospholipid chỉ hình thành các lớp đơn phân tử, ổn định bề mặt tiểu phân, góp phần hình thành và ổn định tiểu phân nano lipid rắn [42].
Sự phối hợp phospholipid ảnh hưởng đến hệ qua 2 hướng: làm tăng độ tan và hiệu suất mang thuốc, nhưng theo hướng ngược lại, phospholipid tạo thành những tiểu phân nhỏ hơn làm giảm hiệu suất mang thuốc [25]. Với dược chất diclofenac natri, sự có mặt của phospholipid có thể làm tăng tính tương hợp vào cốt lipid thông qua các liên kết yếu [26]. Nghiên cứu cho kết quả sự có mặt của phospholipid ảnh hưởng tích cực đến hệ, đồng thời, khi tăng nồng độ phospholipid, kích thước tiểu phân và PDI của hệ giảm đáng kể, trong khi hiệu suất mang thuốc tăng lên. Kết quả này khá tương đồng với các nghiên cứu của Liu D. [25], [26] và nghiên cứu của Schubert M. A. [42]
4.2.4. Về pH pha ngoại
Trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn, giai đoạn đầu hình thành các giọt nhũ tương, sau đó mới hình thành các tiểu phân nano lipid rắn. Với dược chất tan trong nước, việc hợp nhất dược chất với cốt lipid thấp, đa số dược chất tồn tại trên bề mặt các tiểu phân, chỉ một số tồn tại trong cốt lipid, dẫn đến việc dễ bị thất thoát dược chất ra pha ngoại trong quá trình hình thành tiểu phân nano lipid rắn, kéo theo hiệu suất mang dược chất thấp. Giảm độ tan dược chất trong pha ngoại là một biện
70
pháp để tăng hiệu suất mang thuốc, trong đó, thay đổi pH pha ngoại cho hiệu quả đối với các dược chất có độ tan phụ thuộc vào pH [43], [54].
Diclofenac natri là một chất tan trong nước, có độ tan phụ thuộc vào pH của dung dịch (độ tan giảm khi pH giảm). Nghiên cứu cho thấy, việc điều chỉnh pH pha ngoại (từ 6,1 ban đầu xuống các pH 4, 3, 2,5), cho hiệu suất mang thuốc tăng đáng kể (đạt gần 100% ở pH 2,5), kích thước tiểu phân và PDI cũng có xu hướng tăng. Khi giảm pH pha ngoại, trong quá trình nhũ hóa, dược chất giảm độ tan, giảm thất thoát ra pha ngoại, hơn nữa có thể một phần dược chất tồn tại ở dạng phân tử kết tinh trước, lipid kết tinh sau làm tăng khả năng bao gói dược chất vào trong cốt lipid. Giá trị pKa của diclofenac là khoảng 4, khi pH thấp hơn pKa các tiểu phân dược chất tồn tại chủ yếu ở dạng phân từ (khó tan), khi pH cao hơn 4 các tiểu phân tồn tại chủ yếu ở dạng ion (dễ tan), tại pH 4 các tiểu phân tồn tại ở cả 2 dạng trên (tỉ lệ 1:1). Khi không điều chỉnh pH, giá trị pH pha ngoại trong nghiên cứu vào khoảng 6,1 cao hơn pKa, nghiên cứu lựa chọn pH 3 là pH thích hợp nhất trong bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn (là giá trị thấp hơn pKa 1 đơn vị, tại đó, khoảng trên 90% dược chất tồn tại ở dạng phân tử), pH thấp hơn nữa tuy có hiệu suất mang thuốc gần 100% nhưng kết quả về kích thước tiểu phân và PDI cao nên không được lựa chọn.
Kết quả này cũng tương tự với các nghiên cứu của Liu D. và cộng sự, khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hệ tiểu phân nano lipid rắn diclofenac natri. Theo đó, độ tan dược chất trong pha phân tán đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện hiệu suất mang thuốc, điều này có được dễ dàng khi điều chỉnh pH của pha phân tán, khi pH giảm, kích thước tiểu phân giảm, PDI tăng, hiệu suất mang thuốc tăng trong khi hàm lượng dược chất giảm, pH trên 3 hàm lượng dược chất giảm không đáng kể, khi pH dưới 3, hàm lượng dược chất giảm đột ngột [27].
4.3. Về bào chế gel
Hệ tiểu phân nano lipid rắn sau khi bào chế có độ nhớt thấp, không thuận tiện cho việc sử dụng qua da, do vậy cần được phối hợp vào các dạng bào chế bán rắn khác (kem, gel). Trong đó, phối hợp vào dạng gel thân nước cho kết quả tốt (kích thước tiểu phân ít thay đổi so với hệ tiểu phân nano lipid rắn, ngăn cản được hiện
71
tượng kết tụ và gel hóa, có hình thức thể chất đẹp, có tính bám dính cao, …) [11], [31], [48].
Nghiên cứu đã khảo sát ảnh hưởng sơ bộ và chọn ra các thành phần công thức tốt nhất như trong bảng 3.20. Carbopol được lựa chọn là tá dược tạo gel tốt nhất về mặt cảm quan và khả năng giải phóng. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Bhaskar K. và nghiên cứu của Souto E. B. [11], [48]. Nhiều nghiên cứu trước đây phần lớn đều chọn gel carbopol để chứa các tiểu phân nano lipid rắn [8], [23],