rắn và trong các phép thử giải phóng
2.3.3.1. Định lượng bằng phương pháp UV
Áp dụng để định lượng dược chất trong phép thử giải phóng qua màng sử dụng màng cellulose acetat 0,2 μm.
Qua tham khảo dược điển Việt Nam IV [1], mẫu thử giải phóng được đo quang ở bước sóng 276 nm, so sánh với mẫu chuẩn, từ đó tính ra được lượng dược chất trong mẫu thử. Mẫu chuẩn là dung dịch diclofenac natri trong môi trường dung dịch salin đệm phosphat pH 7,4 nồng độ khoảng 20 μg/ml.
Xây dựng đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch diclofenac natri trong môi trường dung dịch salin đệm phosphat pH 7,4: chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ lần lượt là 5, 10, 15, 20, 30 μg/ml; tiến hành đo mật độ quang của dãy dung dịch trên; từ đó xây dựng đường chuẩn biểu hiện mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ dược chất.
30
Qua tham khảo dược điển Mỹ USP30 [52] và qua các khảo sát sơ bộ cùng với điều kiện trên thực tế, lựa chọn phương pháp định lượng dược chất bằng phương pháp HPLC với các điều kiện cụ thể như sau:
+ Hệ thống sắc ký Agilent Infinity 1260
+ Cột sắc ký Zorbax Eclipse XBD C18 250 x 4,6 mm, kích thước hạt nhồi 5μm
+ Pha động: dung dịch đệm phosphat (pH 2,5) : methanol (20:80). Dung dịch đệm được lọc qua màng 0,45 μm, siêu âm trong 15 phút
+ Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 20 μl
+ Detector UV phát hiện ở bước sóng 254 nm.
Xây dựng đường chuẩn biểu hiện mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ dược chất trong các môi trường
Trong môi trường nước: cân chính xác khoảng 100,0 mg diclofenac natri hòa tan trong khoảng 40 ml nước, siêu âm khoảng 5 phút cho dược chất tan hoàn toàn, bồ sung vừa đủ 50 ml được dung dịch gốc A (nồng độ 2000 μg/ml). Từ dung dịch gốc A, tiến hành pha loãng bằng nước tinh khiết thành một dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ 2, 5, 20, 40, 80, 100, 120, 150 μg/ml. Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch trên, từ đó, dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ diclofenac natri trong môi trường nước.
Trong môi trường ethanol: chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn tương tự như trên với dung môi pha loãng là ethanol. Tiến hành chạy sắc ký dãy dung dịch trên, từ đó, xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ diclofenac natri trong môi trường ethanol.
Thẩm định một số chỉ tiêu của phương pháp định lượng diclofenac natri HPLC bằng môi trường nước
Chuẩn bị mẫu:
+ Mẫu chuẩn: cân chính xác khoảng 100,0 mg diclofenac natri hòa tan hoàn toàn trong khoảng 40 ml nước, thêm vừa đủ 50 ml nước được dung dịch (nồng độ
31
2000 μg/ml). Từ dung dịch A pha loãng bằng nước tinh khiết đến nồng độ 100 μg/ml, lọc qua màng lọc 0,45 μm.
+ Mẫu trắng tá dược: bào chế hệ tiểu phân nano lipid rắn theo mô tả ở mục 2.3.2.2 với các thành phần trong bảng 2.3. Hệ sau khi bào chế được xử lý như sau: hút khoảng 2 ml hệ cho vào phần thân của ống siêu ly tâm Milipore® UFC801008 Amicon®, tiến hành ly tâm ở tốc độ 4000 vòng/phút, nhiệt độ 250C, trong khoảng 60 phút. Hút lấy phần dịch trong ở đáy ống, pha loãng 20 lần bằng nước tinh khiết thu được mẫu trắng tá dược.
+ Mẫu thử: tiến hành tương tự với mẫu trắng tá dược nhưng pha dầu được thêm vào khoảng 100 mg dược chất.
Bảng 2.3. Thành phần các chất trong mẫu trắng tá dược
Pha dầu GMS 1,5 g
P90G 0,3 g
Pha nước Tween 80 2 g
Nước cất vừa đủ 50 ml
Độ đặc hiệu: xử lý mẫu theo quy trình nêu trên. Tiến hành chạy sắc ký các mẫu: mẫu trắng tá dược, mẫu chuẩn, mẫu thử. Ghi lại các sắc ký đồ và đáp ứng pic tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn diclofenac natri.
Độ đúng và độ lặp lại: tiến hành thẩm định độ đúng và độ lặp lại của phương pháp trên 3 lô mẫu diclofenac natri có nồng độ tương ứng là 80, 100, 120 μg/ml trong nền tá dược. Xác định hàm lượng dược chất trong các mẫu tá dược bằng cách so sánh với mẫu chuẩn phân tích trong cùng điều kiện. Từ nồng độ chuẩn gốc trong tá dược (2000 μg/ml), tiến hành pha các nồng độ chuẩn làm việc tương ứng 80, 100, 120 μg/ml (mỗi nồng độ 2 mẫu). Tiến hành tương tự với 2 nồng độ chuẩn gốc khác (khoảng 2000 μg/ml). Độ đúng của phương pháp là tỷ lệ phần trăm giữa nồng độ tìm được và nồng độ chuẩn thêm vào, tỷ lệ này phải nằm trong khoảng 98-102%. Độ lặp của phương pháp được đánh giá bằng RSD%, RSD% không vượt quá 2%.