2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
2.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Sta. aureus hay tụ cầu vàng là một loại tụ cầu khuẩn Gram dương, kỵ khắ tùy nghi và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loại tụ cầu (Kluytmans và cs, 1997) [31].
Khi vào da, tụ cầu vàng tác ựộng vào cả miễn dịch tại chỗ (Topical immune) và toàn thân (Systemic immune), ảnh hưởng ựến cả miễn dịch tự nhiên (innate immune) lẫn miễn dịch thu ựược (adaptive immune). Miễn dịch tự nhiên tại chỗ bao gồm nhiều yếu tố, trong ựó các thụ cảm thể TLRs của tế bào da, tế bào Langerhan, tế bào ựuôi gai có vai trò nhận biết các kháng nguyên của tụ cầu như LTA, PGN, DLPẦ sau khi xử lý sẽ kắch thắch các tế bào này sản xuất ra các cytokine kắch hoạt các ựáp ứng miễn dịch tại chỗ và toàn thân bao gồm hoạt hóa các Lympho T chuyển thành Th2 và sản xuất IL 4, 5, 13, TNF-α; các cytokine này tương tác và kắch hoạt lympho B sản xuất các kháng thể, IFE, tăng sinh bạch cầu ưa axit và tế bào sợiẦ biểu hiện là các phản ứng dị ứng. LTA của thành tụ cầu vàng kắch thắch tế bào ựại thực bào và bạch cầu ựơn nhân tiết ra các cytokine có vai trò quan trọng trong phản ứng viêm như TNF-α , IL-1β, IL-10, IL-12, IL-8, leukotriene B4, yếu tố bổ thể 5a, MCP-1, MIP-1α và GM-CSF. PGN từ tụ cầu vàng kắch thắch ựại thực bào, bạch cầu ựơn nhân giải phóng TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 và gây ra ựáp ứng viêm (Bénédicte Fournier và Dana J. P., 2005) [16].
Enterotoxin B của tụ cầu gồm 239 axit amin và có trong lượng phân tử là 28kd. đây là 1 trong 6 ựộc tố kháng nguyên protein riêng biệt ựã ựược xác ựịnh (A, B, C, D, E, G). SEB có cấu trúc nhỏ gọn và ựược ựánh giá cao sức kháng với proteases, trong ựó có trypsin, chymotrypsin và papain ở trong lòng ruột.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 26 Hiện nay người ta cũng ựã thành công trong giải trình tự gen của các chủng tụ cầu vàng ựược ựược ký hiệu: Newman, COL, UMRSA 252, MW2, MSSA476, N315, Mu50, RF122Ầ (Baba T. và cs, 2008) [13].
Steven R. G. và cs (2005) [43] ựã thành công trong việc giải trình tự bộ gen dài 2809422 bp của chủng Sta. aureus COL. Kết quả giải trình tự ựã ựược ghi nhận trên Genbank với mã số: CP000046.1 cho hệ gen nhân và CP000045 cho hệ gen plasmid. Theo ựó, trình tự gen của tụ cầu vàng có chứa ắt các cặp G-C, ựiều này gây ra mối quan ngại về sự chuyển gen từ các chủng tụ cầu vàng tới các tác nhân gây bệnh Gram dương khác.
Trong các dạng ựộc tố ruột do Sta. aureus sinh ra thì các ựộc tố SEA, B, C và D là những ựộc tố thường gặp nhất trong các vụ ngộ ựộc thực phẩm do ựộc tố của tụ cầu. SEB là một trong các nội ựộc tố ựược sinh ra bởi vi khuẩn Sta. aureus. Thông thường khi bị lây nhiễm vào cơ thể, SEB sẽ tác
ựộng chủ yếu lên các hệ thống vận chuyển ion và nước của ruột, do ựó ựược gọi là enterotoxin (ựộc tố ruột), nó còn ựược xếp vào một trong những nhóm ựộc tố do vi sinh vật sản sinh ra ựược liệt kê trong danh mục vũ khắ sinh học dùng ựể tấn công khủng bố sinh học và chiến tranh sinh học (Bruce A. G., 2009) [18]
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 27
Chương 2
đỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. đối tượng và phạm vi nghiên cứu
* đối tượng nghiên cứu:
- Vi khuẩn Sta. aureus gây bệnh cho gà Ross 308 nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương.
* địa ựiểm nghiên cứu:
- địa ựiểm lấy mẫu:
+ Trạm nghiên cứu chăn nuôi gà Phổ Yên Ờ Thái Nguyên (Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương).
- địa ựiểm xét nghiệm mẫu:
Phòng thắ nghiệm bộ môn Vệ sinh thú y Ờ Viện thú y Quốc gia.
* Thời gian nghiên cứu: từ năm 2012 ựến năm 2013.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1. Xác ựịnh tỷ lệ nhiễm Sta. aureus trên gà Ross 308.
- Xác ựịnh tỷ lệ nhiễm Sta. aureus trên ựàn gà Ross 308 nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương.
- Xác ựịnh tỷ lệ nhiễm bệnh Sta. aureus theo lứa tuổi gà.
- Xác ựịnh tỷ lệ nhiễm bệnh Sta. aureus theo phương thức nuôi. - Xác ựịnh tỷ lệ nhiễm bệnh Sta. aureus theo mùa vụ.
2.2.2. Nghiên cứu một số ựặc ựiểm bệnh lý của bệnh do Sta. aureus gây ra ở gà gà
- Theo dõi triệu chứng lâm sàng của gà bị bệnh do Sta. aureus gây ra. - Theo dõi bệnh tắch của bệnh do Sta. aureus gây ra trên gà.
2.2.3. Phân lập vi khuẩn Sta. aureus
- Phân lập vi khuẩn Staphylococus gây bệnh cho gà Ross 308.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 28
2.2.4. Nghiên cứu biện pháp phòng trị bệnh
- Xác ựịnh kháng sinh mẫn cảm với vi khuẩn Sta. aureus và phác ựồ ựiều trị bệnh Sta. aureus cho gà.
- đề xuất biện pháp phòng bệnh do Sta. aureus gây ra cho gà.
2.3. Vật liệu nghiên cứu
- Mẫu bệnh phẩm gà (tim, gan, phổi, lách) ựể phân lập vi khuẩn gây bệnh.
- Gà bệnh ựể thử nghiệm hiệu quả của phác ựồ ựiều trị bệnh. - Thuốc ựiều trị bệnh do Sta. aureus gây ra cho gà.
- Bộ ựồ giải phẫu: Dao, kéo, pank, lam kắnh, ựĩa lồngẦ - Các hóa chất và dụng cụ thắ nghiệm cần thiết khác.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp xác ựịnh tỷ lệ nhiễm bệnh do Sta. aureus gây nên trên ựàn gà. ựàn gà.
Xác ựịnh tỷ lệ nhiễm bệnh do Staphylococus gây ra trên ựàn gà Ross 308 bằng phương pháp quan sát trực tiếp và thông qua mổ khám. đàn gà thắ nghiệm ựược nuôi ở ựiều kiện giống nhau theo quy trình chăn nuôi của Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương và ựược nghi chép theo dõi hàng ngày.
2.4.2. Phương pháp theo dõi triệu chứng của gà bị bệnh
Theo dõi triệu chứng bằng cách quan sát trực tiếp trạng thái của ựàn gà hàng ngày. Bắt nuôi riêng những gà có triệu chứng của bệnh. Quan sát, ghi chép cụ thể các biểu hiện lâm sàng của gà ở khớp cánh, khớp gối, da và thể trạng, ăn uống, vận ựộng của gà.
2.4.3. Phương pháp xác ựịnh bệnh tắch ựại thể
Xác ựịnh các bệnh tắch ựại thể của gà bị bệnh do Sta. aureus gây ra bằng phương pháp mổ khám thông thường (Tài liệu tiêu chuẩn ngành Ờ Cục thú y, 2006).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 29
2.4.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn Staphylococus gây bệnh cho gà Ross 308 Ross 308
- Phương pháp lấy mẫu: Lấy mẫu bệnh phẩm bao gồm tim, gan, phổi, lách ựược bỏ trong hộp nhựa bảo quản trong thùng bảo ôn ựể chuyển về phòng thắ nghiệm. Có thể lấy cả gà ốm hoặc gà nghi mắc Sta. aureus ựể chuyển ựến phòng thắ nghiệm.
- Phân lập vi khuẩn Sta. aureus theo quy trình ISO 6888-1:1999 của Viện thú y.
* Quy trình phân lập Sta. aureus
- Dụng cụ, môi trường:
+ Túi dập mẫu
+ Máy ựồng nhất mẫu + Tủ ấm 370C
+ Tủ ấm 300C + Máy water bass + đĩa petri
+ Que cấy nhựa 1ộ + Que cấy nhựa 10 ộ + Ống eppendorf 2ml + Ống nghiệm thủy tinh
+ Pipette các loại 20 ộ, 100 ộ, 200 ộẦ
+ Môi trường MSB (Manitol Salt Broth), Pair Backer Agar (PBA), Nutrient agar,Ầ
- Các bước tiến hành:
Bước 1: Tăng sinh và phân lập
- Mẫu ựược ựồng nhất và pha loãng ở các nồng ựộ 10-1, 10-2, 10-3Ầ tùy theo nồng ựộ cần nuôi cấy.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30 - Hút 1 ml dung dịch mẫu ựã pha loãng ở các nồng ựộ 10-1, 10-2, 10-3... vào các ống nghiệm thủy tinh có chứa 9ml MSB tương ứng với nồng ựộ cần nuôi cấy. Ủ ấm ở 370C/24h.
- Sau 24h, cấy chuyển sang môi trường PBA, nuôi cấy 370C/48h.
- đọc kết quả trên môi trường PBA sau 48h: Mẫu dương tắnh khi trên môi trường PBA xuất hiện khuẩn lạc tròn, lồi, có tâm ựen, trong suốt, ựường kắnh 1 Ờ 1,5 mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc.
- Chọn những khuẩn lạc ựặc trưng ria cấy sang môi trường Nutrient Agar, ử ở 370C trong 24h.
Bước 2: Thử các phản ứng sinh hóa
- Chọn khuẩn lạc từ môi trường Nutrient Agar:
+ Nhuộm gram
+ Thử phản ứng Catalase: Sta. aureus (+) tắnh với Catalase
+ Cấy chuyển sang môi trường thạch máu ựể kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn.
- đồng thời, cấy vào ống môi trường BHI, ủ ở 370C trong 24h.
- Lấy canh khuẩn ựã ựược nuôi cấy trên BHI, cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết tương thỏ và ủ ở 370C/24h, quan sát ghi nhận sự ngưng kết trong 30/lần. Tiếp tục ủ ựến 24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Thực hiện song song một ống ựối chứng không ựược cấy dịch vi sinh vật. Mẫu ựược kết luận là có Sta. aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tắnh (nghĩa là có sự xuất hiện của khối ựông trong khi ống ựối chứng thì không có).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 31
Sơ ựồ quy trình phân lập Sta. aureus
(Theo ISO 6888-1:1999) hoặc TCVN 4830 - 2005
Mẫu (pha loãng ở nồng ựộ 10-1, 10-2, 10-3Ầ)
Baird Ờ Parker(Nuôi cấy ở 370C, 48hổ2h)
Tăng sinh trong môi trường MSB, nuôi cấy 370C/24h
Ria cấy trên thạch Blood Agar (370C/24h)
Dung huyết hoàn toàn Chọn khuẩn lạc ựặc trưng trên Baird - Parker
Kiểm tra ựông vón huyết tương
Dương tắnh
Sta. aureus
Ria cấy trên thạch dinh dưỡng Nutrient Agar (370C/24)
Nhuộm Gram Phản ứng
Catalase
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 32
2.4.5. Phương pháp xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn. vi khuẩn.
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập ựược bằng phương pháp khuếch tán trên ựĩa thạch. Phương pháp tiến hành như sau:
Bước 1. Chuẩn bị môi trường
- Muller Hinton: cân 38 gam môi trường trong 1lắt nước cất, hấp ở 1210C trong 15 phút, ựể nguội, ựổ ựĩa petri 90mm.
- Khoanh giấy tẩm kháng sinh các loại.
- Nước sinh lý: cân 0,85g NaCl hòa tan trong 1000 ml nước cất, hấp ở 1210C trong 15 phút.
Bước 2. Chuẩn bị các thiết bị, máy móc, dụng cụ, hoá chất dùng trong thắ nghiệm.
- Thiết bị: Tủ ấm, tủ lạnh, tủ mát, tủ hấp sấy, cân, buồng cấy vô trùng.
- Dụng cụ: Pipet, ống nghiệm, chai lọ các loại, que cấy, tăm bôngẦ và hoá chất cần thiết trong phòng thắ nghiệm
Bước 3. Tiến hành thắ nghiệm: Thực hiện theo phương pháp so màu của Mc
Farland
Lấy 1 số khuẩn lạc vi khuẩn cần thử trên ựĩa thạch thắch hợp vào ống thủy tinh trong suốt ựã chứa 3ml nước sinh lý cho ựến khi có ựộ ựục bằng ống Mc Farland 0,5 Ờ tương ựương 1-1,5 x 108 vi khuẩn/ml. Nhỏ 1ml canh khuẩn vừa chuẩn bị lên bề mặt thạch, láng cho canh khuẩn ựều ở mặt thạch. Chờ 5 phút cho canh khuẩn ngấm vào ựĩa thạch, dùng pipet hút bỏ phần canh khuẩn còn lại trên ựĩa thạch, ựể ựĩa thạch khô. Hoặc dùng tăm bông vô trùng thấm vào canh khuẩn ựã chuẩn bị, sau ựó ria cấy 3 ựường lên bề mặt thạch, mỗi ựường lệch nhau 600, cuối cùng ria ra xung quanh góc ựĩa thạch. đặt các khoanh giấy tẩm các loại kháng sinh lên bề mặt thạch (không quá 6 khoanh ựối với ựĩa petri 90mm). để tủ ấm ở 370C trong vòng 24 giờ, ựọc kết quả bằng cách dùng bút ựo ựường kắnh của vòng vô khuẩn phắa dưới mặt ựĩa.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 33
2.4.6. Phương pháp thử nghiệm hiệu lực của 3 phác ựồ ựiều trị bệnh cho gà
Thử nghiệm hiệu lực của 3 phác ựồ ựiều trị bệnh do Staphylococcus
gây ra trên gà theo phương pháp phân lô so sánh.
Dựa vào kết quả kháng sinh ựồ, lựa chọn 3 loại kháng sinh mẫn cảm nhất ựể thử nghiệm hiệu quả trên gà. Chúng tôi chia gà làm 3 lô và thử nghiệm thuốc từ ựó tìm ra loại thuốc có hiệu quả cao nhất. Các chỉ tiêu theo dõi bao gồm: Triệu chứng lâm sàng, bệnh tắch, tỷ lệ chết, tỷ lệ khỏi bệnh, các chỉ tiêu kỹ thuật.
Thắ nghiệm ựược bố trắ theo sơ ựồ sau:
Chỉ tiêu theo dõi Phác ựồ 1 Phác ựồ 2 Phác ựồ 3
Tỷ lệ gà hết bị viêm khớp Tỷ lệ gà hết viêm da Tỷ lệ khỏi bệnh Tỷ lệ chết
2.4.7. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập ựược xử lý và phân tắch theo phương pháp thống kê sinh học và phần mềm Microsoft Excell 2007.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 34
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tỷ lệ mắc Staphylococcosis trên gà Ross 308
3.1.1. Tỷ lệ nhiễm Sta. aureus trên ựàn gà Ross 308 nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương. nghiên cứu gia cầm Thụy Phương.
Chúng tôi tiến hành theo dõi ựàn gà Ross 308 nuôi từ 01 ngày tuổi ựến 40 tuần tuổi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương thông qua quan sát trực tiếp và mổ khám ựể xác ựịnh tỷ lệ gà nhiễm Sta. aureus . Kết quả theo dõi ựược trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm Sta. aureus trên ựàn gà Ross 308 nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương Số lượng gà theo dõi
(con)
Số lượng gà nhiễm
Sta. aureus(con) Tỷ lệ nhiễm (%)
3387 122 3,60
Kết quả trình bày ở bảng 4.1 cho thấy: trong các giai ựoạn tuổi tỷ lệ nhiễm bệnh do Sta. aureus gây nên là khá cao, số gà nhiễm Sta. aureus là 122 con, chiếm 3,60% trong tổng số gà theo dõi.
Như vậy, chúng ta có thể thấy rằng: tỷ lệ gà bị nhiễm Sta. aureus chiếm 3,60% tổng ựàn, ựiều này làm ảnh hưởng không nhỏ ựến năng suất của ựàn gà.
3.1.2. Tỷ lệ nhiễm Sta. aureus theo lứa tuổi
Như chúng ta ựã biết, mức ựộ cảm nhiễm bệnh cũng như khả năng chống ựỡ bệnh tật của gà ở mỗi lứa tuổi khác nhau thì khác nhau. Do vậy, ựiều tra tỷ lệ nhiễm Sta. aureus theo từng lứa tuổi gà ựể có kế hoạch phòng trị bệnh thắch hợp, nhằm nâng cao năng suất chăn nuôi gà.
Chúng tôi ựã tiến hành theo dõi bệnh do Sta. aureus qua các giai ựoạn tuổi. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.2.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 35
Bảng 4.2. Tỷ lệ nhiễm Sta. aureus theo tuổi gà
Thứ tự Tuần tuổi Số lượng gà (con) Số lượng gà nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm % 1 0 Ờ 4 3500 20 0,57 2 5 Ờ 8 3465 5 0,14 3 9 Ờ 12 3445 21 0,61 4 13 Ờ 16 3412 8 0,23 5 17 Ờ 20 3390 5 0,15 6 21 Ờ 24 3369 7 0,21 7 25 Ờ 28 3351 11 0,33 8 29 Ờ 32 3332 12 0,36 9 33 Ờ 36 3311 13 0,39 10 37 Ờ 40 3290 20 0,61
Kết quả trình bày ở bảng 4.2. cho thấy:
Gà ở tất cả các giai ựoạn tuổi ựều bị nhiễm Sta. aureus. Tuy nhiên tỷ lệ nhiễm Sta. aureus là khác nhau trong các giai ựoạn tuổi. Cụ thể như sau:
Giai ựoạn gà từ 01 ngày tuổi Ờ 4 tuần tuổi: Trong 3500 gà theo dõi và kiểm tra có 20 gà nhiễm Sta. aureus chiếm tỷ lệ 0,57%. Trong quá trình theo dõi chúng tôi thấy ở giai ựoạn này gà chủ yếu mắc ở tuần tuổi thứ 1 và thứ 2.
đến giai ựoạn từ 5 Ờ 8 tuần tuổi tỷ lệ nhiễm Sta. aureus ở gà giảm
xuống chỉ còn 0,14%. đây là giai ựoạn gà nhiễm Sta. aureus thấp nhất trong các giai ựoạn theo dõi. Tuy nhiên ựến giai ựoạn 9 Ờ 12 tuần tuổi thì tỷ lệ nhiễm
Sta. aureus lại tăng cao. Trong 3445 gà theo dõi và kiểm tra có tới 21 gà nhiễm Sta. aureus tương ứng 0,61%. đây là giai ựoạn gà mắc bệnh cao nhất với lý do là trong giai ựoạn này gà ăn hạn chế với số lượng và chất lượng giảm rất nhiều ựể sau này có khả năng sinh sản cao do vậy sức sức ựề kháng của ựàn gà bị giảm, gà rất dễ nhiễm các bệnhtrong ựó có bệnh do Sta. aureus.