2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
2.4.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn Staphylococus gây bệnh cho
Ross 308
- Phương pháp lấy mẫu: Lấy mẫu bệnh phẩm bao gồm tim, gan, phổi, lách ựược bỏ trong hộp nhựa bảo quản trong thùng bảo ôn ựể chuyển về phòng thắ nghiệm. Có thể lấy cả gà ốm hoặc gà nghi mắc Sta. aureus ựể chuyển ựến phòng thắ nghiệm.
- Phân lập vi khuẩn Sta. aureus theo quy trình ISO 6888-1:1999 của Viện thú y.
* Quy trình phân lập Sta. aureus
- Dụng cụ, môi trường:
+ Túi dập mẫu
+ Máy ựồng nhất mẫu + Tủ ấm 370C
+ Tủ ấm 300C + Máy water bass + đĩa petri
+ Que cấy nhựa 1ộ + Que cấy nhựa 10 ộ + Ống eppendorf 2ml + Ống nghiệm thủy tinh
+ Pipette các loại 20 ộ, 100 ộ, 200 ộẦ
+ Môi trường MSB (Manitol Salt Broth), Pair Backer Agar (PBA), Nutrient agar,Ầ
- Các bước tiến hành:
Bước 1: Tăng sinh và phân lập
- Mẫu ựược ựồng nhất và pha loãng ở các nồng ựộ 10-1, 10-2, 10-3Ầ tùy theo nồng ựộ cần nuôi cấy.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 30 - Hút 1 ml dung dịch mẫu ựã pha loãng ở các nồng ựộ 10-1, 10-2, 10-3... vào các ống nghiệm thủy tinh có chứa 9ml MSB tương ứng với nồng ựộ cần nuôi cấy. Ủ ấm ở 370C/24h.
- Sau 24h, cấy chuyển sang môi trường PBA, nuôi cấy 370C/48h.
- đọc kết quả trên môi trường PBA sau 48h: Mẫu dương tắnh khi trên môi trường PBA xuất hiện khuẩn lạc tròn, lồi, có tâm ựen, trong suốt, ựường kắnh 1 Ờ 1,5 mm, có vòng sáng chung quanh khuẩn lạc.
- Chọn những khuẩn lạc ựặc trưng ria cấy sang môi trường Nutrient Agar, ử ở 370C trong 24h.
Bước 2: Thử các phản ứng sinh hóa
- Chọn khuẩn lạc từ môi trường Nutrient Agar:
+ Nhuộm gram
+ Thử phản ứng Catalase: Sta. aureus (+) tắnh với Catalase
+ Cấy chuyển sang môi trường thạch máu ựể kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn.
- đồng thời, cấy vào ống môi trường BHI, ủ ở 370C trong 24h.
- Lấy canh khuẩn ựã ựược nuôi cấy trên BHI, cấy vào ống nghiệm nhỏ chứa khoảng 0,3ml huyết tương thỏ và ủ ở 370C/24h, quan sát ghi nhận sự ngưng kết trong 30/lần. Tiếp tục ủ ựến 24 giờ nếu không thấy xuất hiện khối kết tụ. Thực hiện song song một ống ựối chứng không ựược cấy dịch vi sinh vật. Mẫu ựược kết luận là có Sta. aureus khi thử nghiệm coagulase này dương tắnh (nghĩa là có sự xuất hiện của khối ựông trong khi ống ựối chứng thì không có).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 31
Sơ ựồ quy trình phân lập Sta. aureus
(Theo ISO 6888-1:1999) hoặc TCVN 4830 - 2005
Mẫu (pha loãng ở nồng ựộ 10-1, 10-2, 10-3Ầ)
Baird Ờ Parker(Nuôi cấy ở 370C, 48hổ2h)
Tăng sinh trong môi trường MSB, nuôi cấy 370C/24h
Ria cấy trên thạch Blood Agar (370C/24h)
Dung huyết hoàn toàn Chọn khuẩn lạc ựặc trưng trên Baird - Parker
Kiểm tra ựông vón huyết tương
Dương tắnh
Sta. aureus
Ria cấy trên thạch dinh dưỡng Nutrient Agar (370C/24)
Nhuộm Gram Phản ứng
Catalase
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 32