2.2.2.1. Đặc tính nuôi cấy
Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997), Nguyễn Quang Tuyên (2008) vi khuẩn E. coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, có thể sinh trưởng ở phổ nhiệt độ khá rộng (từ 5 - 400C), nhiệt độ thích hợp là 370C và phổ pH rộng (pH từ 5,5 - 8,0), pH thích hợp nhất từ 7,2 - 7,4.
- Môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt bóng láng, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2 - 3mm. Nếu nuôi lâu, khuẩn lạc có màu nâu nhạt và mọc rộng ra, có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucoid).
- Môi trường nước thịt: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn E. coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt, lắng xuống đáy, đôi
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20 khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi thối.
- Trên môi trường MacConkey: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, khuẩn lạc có màu cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
- Trên môi trường thạch máu: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, hình thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu sáng, có thể có hoặc không có dung huyết, tuỳ thuộc vào chủng vi khuẩn.
- Trên môi trường Endo: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đỏ mận chín, hoặc không có ánh kim.
- Trên môi trường EMB (Eosin Methyl Blue): sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc màu tím đen có ánh kim.
- Trên môi trường thạch SS: E. coli phát triển thành các khuẩn lạc có màu đỏ. - Trên môi trường thạch Brilliant Green Agar: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37oC, vi khuẩn E. coli hình thành khuẩn lạc dạng S (Smooth), màu vàng chanh.
2.2.2.2. Đặc tính sinh hoá
* Đặc tính lên men và sinh hơi các loại đường:
Vi khuẩn E. coli có khả năng lên men và sinh hơi các loại đường: Lactose, Fructose, Glucose, Levulose, Galactose, Manitol, xylose; lên men không chắc chắn các loại đường Dulcitol, Saccarose, Salixin. Trong đó, vi khuẩn E.coli lên men sinh hơi nhanh đường Lactose, còn vi khuẩn Samonella spp thì không có đặc tính này, đây là đặc điểm quan trọng để phân biêt vi khuẩn E. coli và Samonella.
* Các đặc tính khác:
Sữa: Đông sau 24 – 72h ở 370C Genlatin: Không tan chảy Các phản ứng:
Indon + Di động +
Catalacza + Oxydaza -
MR + VP -
H2S - Ureaza -
Vi khuẩn E. coli có khả năng khử Nitrat thành Nitrit, khử Cacboxyl trong môi trường lysine decacboxylase.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21
2.2.3. Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn E. coli
2.2.3.1. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E. coli
Theo Faubert (1992), vi khuẩn E. coli bằng cách gián tiếp hoặc trực tiếp xâm nhập vào đường ruột. Trong ruột, khi có đủ các điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nhân lên với số lượng lớn, sản sinh yếu tố kháng khuẩn (Colicin V). Yếu tố này tiêu diệt các vi khuẩn đường ruột khác, đặc biệt là những vi khuẩn có lợi như: B. subtilis, các vi khuẩn sinh lactic. Khi có số lượng lớn, chiếm ưu thế, vi khuẩn tràn lên ở ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bám dính (Fimbriae), nhờ thế mà vi khuẩn không bị nhu động ruột đẩy ra ngoài. Sau đó, vi khuẩn đã qua hàng rào bảo vệ lớp Mucosa trên bề mặt niêm mạc ruột vào tế bào biểu mô. Tại đây, vi khuẩn phát triển, nhân lên làm phá huỷ các lớp tế bào biểu mô, gây viêm ruột. Đồng thời vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxin) bao gồm: yếu tố chịu nhiệt (ST), làm tăng tính thẩm xuất của tế bào thành ruột và phá huỷ chúng; Yếu tố không chịu nhiêt (LT) sẽ tác động vào quá trình trao đổi muối, nước làm rối loạn chu trình này. Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căng ruột, cùng với khí do lên men ở đường ruột, tạo ra một tác dụng cơ học làm nhu động ruột đẩy nước và thức ăn, gây hiện tượng tiêu chảy. Sau khi đã phát triển ở thành ruột vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn (làm nhiễm trùng máu). Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào, gây dung huyết làm cho cơ thể bị thiếu máu. Từ hệ thống tuần hoàn vi khuẩn theo các vi quản đến các hệ thống cơ quan khác.
2.2.3.2. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli
Các yếu tố gây bệnh của E. coli bao gồm khả năng kháng khuẩn, yếu tố bám dính, khả năng xâm nhập, yếu tố gây dung huyết và khả năng sản sinh độc tố. Các chủng vi khuẩn E. coli không có các yếu tố trên thì không có khả năng gây bệnh. Dựa vào các yếu tố gây bệnh nói trên, người ta đã phân loại vi khuẩn E. coli
thành các loại sau: Enterotoxigenic E. coli (ETEC), Enteropathogenic E. coli
(EPEC), Adherence Enteropathogenic E. coli (AEEC) và Verotoxingenic E. coli
(VTEC) (Lê Văn Tạo, 1997). Trong đó, các chủng vi khuẩn thuộc nhóm ETEC và VTEC thường gây bệnh tiêu chảy cho lợn con sơ sinh và lợn sau cai sữa (Fairbrother, 1992).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22
* Yếu tố kháng khuẩn
Nhiều chủng vi khuẩn E. coli có khả năng sản sinh ra chất kháng khuẩn có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác, gọi là Colicin V. Vì vậy, yếu tố này cũng được coi là 1 trong các yếu tố độc lực của vi khuẩn E. coli gây bệnh.
* Yếu tố bám dính
Để gây bệnh, các chủng ETEC phải bám dính lên trên tế bào biểu mô của ruột non. Quá trình bám dính được thực hiện qua 3 giai đoạn: hấp thu, gắn kết và bám dính. Giai đoạn hấp thu và gắn kết được thực hiện nhờ các tác động vật lý, hóa học; bước bám dính được thực hiện bởi các sợi bám dính chuyên biệt (pili) trên bề mặt vi khuẩn, đó là quá trình liên kết giữa kháng nguyên tại yếu tố bám dính với các receptor tương ứng trên bề mặt của các tế bào biểu mô. Hầu hết các chủng ETEC đều có các yếu tố bám dính bao gồm: K88 (F4); K99 (F5); 987P (F6); F17; F18; F41; F42; F165. Fimbriae là sự tập hợp của các đơn vị protein nhỏ, được sắp xếp thành những sợi dây nhỏ gắn vào tế bào và có tính miễn dịch cao. Các sợi bám dính và độc tố đường ruột của các chủng ETEC nhìn chung được di truyền bởi plasmid ngoại trừ F41 và F17 (Nagy và cs, 1999). Ở lợn, các chủng vi khuẩn ETEC gây bệnh tiêu chảy thường mang các yếu tố bám dính sau đây:
- F4 (K88)
F4 hay còn gọi là K88 đầu tiên được mô tả bởi Orskov và cs (1961) và là một kháng nguyên không chịu nhiệt, không được sản sinh ở nhiệt độ 18oC. Theo nghiên cứu trước kia của Kauffman (1947) kháng nguyên bề mặt này được cho là kháng nguyên vỏ (K) có bản chất là polysaccharide vì thế chúng được coi là K88. Bằng việc sử dụng các kháng huyết thanh đặc hiệu, Orskov và cs (1978) đã phân biệt được hai loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac. Loại thứ 3 được phát hiện bởi Guinee và Jansen được đặt tên là F4ad (Guinee và cs, 1979). Sợi F4 giúp cho vi khuẩn bám được vào receptor tương ứng của nó trên tế bào biểu mô của lông nhung ruột non, từ đó vi khuẩn có thể xâm nhập cố định và phát triển được ở thành ruột non. Yếu tố bám dính F4 được mang trong vi khuẩn E. coli thuộc nhóm ETEC, gây bệnh tiêu chảy ở lợn trước và sau cai sữa (Nagy và cs, 1999).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23 F5 trước kia được cho là kháng nguyên bám dính của E. coli chỉ gây bệnh ở bê, nghé và cừu. Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng được tìm thấy với tỷ lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ lợn tiêu chảy (Links và cs, 1985). Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: Tốc độ sinh trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong môi trường. Các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid.
- F6 (987p)
Các nhà khoa học cho rằng fimbriae này đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh của ETEC. F6 của ETEC ở lợn có thể giúp vi khuẩn bám vào cả các receptor cấu tạo bởi glycoprotein và glycolipid trên riềm bàn chải của các tế bào biểu mô ruột (Dean và cs, 1994). F6 bám dính ở màng nhầy để phân phối độc tố đường ruột tối đa đến vật chủ.
- F18
F18 là tên đặt cho nhân tố bám dính 8813. Bởi vậy, một loại fimbriae mới đã được đề nghị công nhận là F18ab và F18ac (Rippinger và cs, 1995). Một nghiên cứu của Nagy và cs (1996) thấy rằng F18ab và F18ac khác nhau về mặt sinh học. F18ab ít thấy thể hiện ở cả trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm. Chúng thường thấy cùng với việc sản xuất SLT-2e ở các chủng VTEC, trong khi F18ac thể hiện rất rõ ở cả trong thực tế và trong phòng thí nghiệm, chúng mang các đặc tính của các chủng ETEC.
Một đặc điểm đáng chú ý ở F18ac là chúng không bám vào riềm bàn chải của các tế bào biểu mô ruột của lợn sơ sinh trong điều kiện thực tế và trong phòng thí nghiệm (Nagy và cs, 1992), cũng không tập trung ở lớp màng nhầy của ruột ở lợn con mới sinh (Casey và cs, 1992). Điều này là hoàn toàn trái ngược với F5 và F6, chúng bám vào các tế bào biểu mô ruột. Khả năng bám này ở lợn cai sữa nhiều hơn so với lợn sơ sinh. Đây chính là lý do xác đáng để giải thích về việc tăng sự mẫn cảm với khả năng bám dính của F18ab và F18ac theo tuổi của lợn vẫn chưa được làm rõ, nhưng có thể là do sự tăng dần các receptor đặc hiệu ở lông nhung của ruột lợn từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Sự thiếu hụt các receptor của F18ab và F18ac ở lợn sơ sinh có thể giải thích cho lý do vì sao chỉ thấy các chủng VTEC và ETEC ở
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 lợn cai sữa (Nagy và cs, 1999).
* Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E. coli
Yếu tố xâm nhập của vi khuẩn E. coli là một khái niệm dùng để chỉ quá trình mà nhờ đó vi khuẩn qua được hàng rào bảo vệ của lớp nhầy (mucosa) trên bề mặt niêm mạc, để xâm nhập vào tế bào biểu mô (epithel), đồng thời sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó, những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua được hàng rào bảo vệ của lớp mucosa hoặc khi qua được sẽ bị bắt bởi tế bào đại thực bào của tổ chức niêm mạc.
* Độc tố của vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli sản sinh nhiều loại độc tố: Enterotoxin, Verotoxin, Neurotoxin. Mỗi loại độc tố gắn với một thể bệnh mà chúng gây ra.
- Nhóm độc tốđường ruột (Enterotoxin): Gồm hai loại:
+ Độc tố chịu nhiệt (Heat Stable Toxin - ST): Độc tố này chịu được nhiệt độ 100oC trong vòng 15 phút. Độc tố ST chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên đặc tính sinh học và khả năng hòa tan trong methanol. STa kích thích sản sinh ra cGMP mức cao trong tế bào, ngăn trở hệ thống chuyển Na+ và Cl- , làm giảm khả năng hấp thu chất điện giải và nước ở ruột. STa thường thấy ở ETEC gây bệnh ở lợn < 2 tuần tuổi và ở lợn lớn.
STb kích thích vòng nucleotid phân tiết dịch độc lập ở ruột, nhưng phương thức tác dụng của STb vẫn chưa được hiểu rõ. STb hoạt động ở ruột non lợn, nhưng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi Trypsin. STb tìm thấy được ở 75% các chủng vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con, 33% phân lập từ lợn lớn (Fairbrother và cs, 1992). Vai trò của STb trong tiêu chảy chưa được biết đến, mặc dù ETEC sản sinh STb có thể kích thích gây tiêu chảy ở lợn con trong điều kiện thực nghiệm và STb làm teo lông nhung ruột lợn (Carter và cs, 1995).
Cả STa và STb đều có vai trò quan trọng trong việc gây tiêu chảy do các chủng E. coli gây bệnh ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con và trẻ sơ sinh.
+ Độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT): độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 60oC trong vòng 15 phút. LT cũng có hai nhóm phụ LT1 và LT2, nhưng chỉ có LT1 bị trung hòa bởi Anti-cholerae toxin. LT là một trong những yếu tố quan
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25 trọng gây triệu chứng tiêu chảy (Faibrother và cs, 1992). Cả 2 loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở nhiệt độ -20oC.