- Nhóm độc tố tế bào (Shiga /Verotoxin)
3. NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.6. Phương pháp giám định một số đặc tính sinh học chủ yếu của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được
khuẩn E. coli phân lập được
3.4.6.1. Phản ứng sinh Indol
- Nguyên lý: trong môi trường không có đường mà chỉ có Pepton, một số vi khuẩn sản sinh men Tryptophataza làm phân giải axit amin Tryptophan để sinh Indol.
- Cách tiến hành: cấy vi khuẩn vào môi trường Trypton, bồi dưỡng tủ ấm 37oC trong 24 giờ, lấy ra rồi nhỏ vào môi trường 5-6 giọt dung dịch Kovac's, quan sát trong vòng 1 phút.
- Đánh giá kết quả:
+ Phản ứng dương tính: trên bề mặt môi trường xuất hiện một vòng tròn màu đỏ + Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu
3.4.6.2. Phản ứng Rouge Methyl (MR)
- Nguyên lý: Vi khuẩn E. coli lên men đường glucoza tạo thành axit piruvic và tiếp tục chuyển hóa axit piruvic thành etanol, axit acetic, H2, CO2, axit lactic và axit xucxinic làm cho pH của môi trường hạ thấp còn ≤ 4,5.
- Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton glucoza, bồi dưỡng ở trong 24-48 giờ, lấy ra rồi nhỏ vào 2 – 3 giọt dung dịch đỏ metyl 0.04% trong cồn 95o, quan sát trong 5 phút.
- Đánh giá kết quả:
+ Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ. + Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu.
3.4.6.3. Phản ứng Voges Proskauer (V.P)
Nguyên lý: Một số vi khuẩn có khả năng lên men glucoza tạo thành axit piruvic, sau đó axit piruvic chuyển thành axetoin, trong môi trường kiềm nó bị oxi hóa thành diaxetyl, diaxetyl sẽ chuyển sang màu đỏ khi kết hợp với nhóm guanidin.
Thuốc thử phản ứng V.P:
+ Dung dịch 1: Alpha naphtol 5 g + Cồn tuyệt đối 100 ml + Dung dịch 2: NaOH 40 g + Nước cất 100 ml
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 Phương pháp tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường pepton glucoza, bồi dưỡng ở trong 24-48 giờ, lấy ra rồi nhỏ vào 5 giọt dung dịch 1 và 2, quan sát sau 5 phút.
- Đánh giá kết quả:
+ Phản ứng dương tính: môi trường chuyển màu đỏ hồng.
+ Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu hoặc màu vàng.
3.4.6.4. Phản ứng lên men đường
- Thành phần của dung dịch pepton:
Pepton: 15 g
Nước cất vô trùng: 1000 ml - Cách tiến hành:
Trong 100 ml môi trường pepton cho vào 1 ml chỉ thị màu Andrader, lắc đều rồi chia ra các ống nghiệm. Mỗi ống 5 ml có ống Durham (để kiểm tra sinh hơi của vi khuẩn).
Pha các loại đường Glucoza, Lactoza…thành dung dịch 10%, hấp ướt 110oC trong vòng 20-30 phút.
Cho vào mỗi ống môi trường nước pepton 5-6 giọt dung dịch đường 10%. Để tủ ấm 37oC trong 24 giờ để kiểm tra nếu có tạp khuẩn thì loại bỏ và thay thế bằng ống môi trường khác. Sau đó cấy vi khuẩn cần giám định vào, rồi bồi dưỡng ở nhiệt độ 37oC trong 24 giờ.
- Đánh giá kết quả: cùng một lúc kiểm tra được 2 tính chất: + Phản ứng lên men đường:
* Phản ứng dương tính: môi trường chuyển thành mầu hồng đỏ * Phản ứng âm tính: môi trường không chuyển màu.
+ Phản ứng sinh hơi:
* Phản ứng dương tính: ống Durham bị đẩy lên và trong ống có một khoảng khí.
* Phản ứng âm tính: ống Durham vẫn ở đáy ống nghiệm, trong ống không có gì.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36