3.1.1. Đặc điểm sinh học vi khuẩn lactic được phân lập
1.1. Đặc điểm sinh học của vi khuẩn lactic
Tổng số 21 chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ nhiều loại thực phẩm lên men chua sử dụng môi trường chọn lọc MRS. Các dòng phân lập được quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào và thử nghiệm hoạt tính catalase. Kết quả cho thấy tất cả các chủng này đều là vi khuẩn Gram dương dạng trực khuẩn hay cầu khuẩn, không sinh bào tử, catalase âm tính. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của chủng điển hình LT4 được thể hiện trên hình 3.1 và 3.2.
1.2. Tốc độ sinh trưởng và phát triển của các chủng vi khuẩn lactic
Một chủng vi khuẩn lactic sinh trưởng và phát triển mạnh thì ngay trên môi trường dịch thể MRS phải tăng nhanh về sinh khối tế bào. Lượng sinh khối tế bào càng lớn thì độ đục của dịch thể MRS càng tăng. Giá trị độ đục của 6 chủng vi khuẩn lactic phát triển tốt nhất trên môi trường dịch thể MRS sau 24 giờ phát triển ở nhiệt độ phòng thể hiện ở Bảng 3.1.
Hình 3.1. Chủng vi khuẩn LT4
Hình 3.2. Tiêu bản nhuộm Gram chủng vi khuẩn LT4
Bảng 3.1. Giá trị độ đục sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS lỏng Nguồn gốc Chủng Độ đục Nguồn gốc Chủng Độ đục
Kim chi LT2 1431 Sữa chua LT10 106,6
Kim chi LT4 1711 Dưa chua LT12 64,3
Nem chua LT7 92 Sữa chua LT13 61
1.3. Khả năng lên men và giảm pH của các chủng lactic đã phân lập
Kết quả đo pH được thể hiện trong Bảng 3.2. pH giảm nhanh là một trong các yếu tố khẳng định tốc độ phát triển mạnh của các dòng vi khuẩn lactic.
Bảng 3.2. pH của nước ép đậu lên men của 6 chủng lựa chọn
Chủng pH Chủng pH
LT2 4,74 LT10 4,56
LT4 3,78 LT12 4,86
LT7 4,67 LT13 4,65
Như vậy từ bảng giá trị pH cho thấy trên môi trường nước ép đậu chủng LT4
vẫn phát triển tốt và làm giảm pH xuống thấp. Bên cạnh pH giảm nhanh trong thời gian ngắn thì chủng được chọn khi lên men nước ép đậu phải có cảm quan tốt, để không ảnh hưởng tới chất lượng đậu phụ sau này.
Chất lượng cảm quan nước ép đậu lên men lactic được thể hiện ở Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả đánh giá cảm quan nước ép đậu lên men lactic
Chủng Mùi Màu sắc Trạng thái
LT2 Mùi thơm sữa đậu nành nhẹ, mùi chua mạnh
Dịch màu trong, hơi vàng
Sữa đậu nành kết tủa mạnh, mịn
LT4 Mùi thơm sữa đậu nành lên men, chua dịu
Dịch vàng trong nổi lên trên
Sữa đậu nành kết tủa mạnh xuống đáy, mịn không sủi bọt
nành lên men, chua gắt hơi ngà vàng ở trên LT10 Mùi nồng khó chịu, hơi chua Dịch trong, màu hơi vàng
Sữa đậu kết tủa và có hiện tượng sủi bọt trong khối kết tủa
LT12 Mùi thơm, mùi đậu nành ít
Lớp nước trên có màu vàng, trong
Sữa đậu nành kết tủa mịn, có một lớp váng nhẹ
LT13 Mùi thơm, chua dịu Dịch màu trắng sữa
Sữa đậu kết tủa, lắc nhẹ có bọt nhầy
Kết quả từ Bảng 3.1, 3.2, 3.3 cho thấy rằng chủng vi khuẩn lactic LT4 có khả năng phát triển mạnh trên môi trường MRS lỏng và trên cả môi trường nước ép đậu phụ, làm giảm pH xuống thấp trong thời gian ngắn. Các kết quả này bước đầu khẳng định rằng chủng LT4 được chọn. Tuy nhiên chủng vi khuẩn được tuyển chọn có đáp ứng đầy đủ yêu cầu ban đầu nghiên cứu đặt ra thì bước tiếp theo cần khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của LT4 so với các chủng còn lại trong 6 chủng được tuyển chọn.
3.1.2. Hoạt tính ức chế các chủng chỉ thị của các chủng lactic tuyển chọn
Sáu chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn được tiến hành thử hoạt tính đối kháng đối với 4 loại vi khuẩn chỉ thị là E. coli, S. typhimurium, L. cytomonogenes, S. aureus qua thử nghiệm cấy điểm và khuếch tán qua giếng thạch.
Hoạt tính kháng khuẩn của những dòng vi khuẩn lactic được đánh giá thông qua bằng đường kính vòng vô khuẩn quanh khuẩn lạc hay quanh miệng giếng trên đĩa thạch.
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp cấy điểm
Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic trong phương pháp cấy điểm được thể hiện như trên Bảng 3.4.
Bảng 3.4. Hoạt tính ức chế các chủng chỉ thị của 6 chủng lactic trong phương pháp cấy điểm
Hoạt tính ức chế (D, d, mm)
E. coli S. aureus S. typhimurium L.
monocytogenes Chủng Vòng Khuẩn lạc Vòng Khuẩn lạc Vòng Khuẩn lạc Vòng Khuẩn lạc LT2 18 6 17 5 14 6 11 6 LT4 24 7 18 5 17 6 14 7 LT7 16 7 15 5 15 6 11 6 LT10 21 7 15 5 14 5 12 5 LT12 12 4 13 4 16 7 11 6 LT13 15 8 13 5 9 5 6 4
Bảng 4 cho thấy 6 chủng chọn lọc do phát triển mạnh đều có khả năng ức chế 4 chủng chỉ thị. Phổ kháng khuẩn rộng (gồm cả vi khuẩn Gram dương và cả vi khuẩn Gram âm). Vòng kháng tương đối lớn đặc biệt là các chủng LT2, LT4, LT10 vòng kháng lớn hơn 10 mm.
Hoạt tính ức chế các chủng chỉ thị của nước ép đậu lên men lactic
Sử dụng dịch nổi thu nhận bằng li tâm nước ép đậu lên men lactic đi thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Kết quả được thể hiện như trong Bảng 3.5.
Hình 3.3. Hoạt tính ức chế E. coli
của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn.
Hình 3.4. Hoạt tính ức chế
S. typhimurium của các chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn.
Bảng 3.5. Hoạt tính ức chế các chủng chỉ thị của 6 chủng lactic trong phương pháp khuếch tán qua giếng thạch
Từ kết quả trong hai Bảng 3.4 và 3.5 cho thấy chủng lactic LT4 được phân lập từ nguồn cải muối chua kim chi có hoạt tính kháng khuẩn mạnh. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Ngô Thị Phương Dung [1].
3.1.3. Kết quả định danh chủng LT4
Kết quả giải trình tự gen 16S rRNA của loài LT4 được thể hiện trong Phụ lục 37. Kết quả tra cứu trình tự gen chỉ ra rằng chủng TL4 thuộc chi Lactobacillus. Chủng vi khuẩn này có mức độ tương đồng là 99% so với L. plantarum và L. pentosus.
3.2. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG THẠCH CAO KẾT TỦA PROTEIN
ĐẬU NÀNH
Kết quả xác định hàm lượng thạch cao dùng để kết tủa protein đậu nành được thể hiện ở bảng Phụ lục 5. Kết quả đánh giá chất lượng cảm quan đậu phụ sản xuất bằng thạch cao được thể hiện ở bảng Phụ lục 6. Dựa vào kết quả thu được ở 2 bảng Phụ lục 5 và Phụ lục 6 cho thấy với hàm lượng thạch cao 4% dùng để kết tủa dịch sữa đậu thì đậu phụ có sản lượng tốt, gel đạt chất lượng không quá mềm cũng không quá cứng.
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN BỔ SUNG VÀO NƯỚC ÉP ĐẬU Bảng 3.6. Giá trị pH của các mẫu nước ép đậu lên men lactic Bảng 3.6. Giá trị pH của các mẫu nước ép đậu lên men lactic
Chủng E. coli S. typhimurium S. aureus L. monocytogenes
Đường kính vòng kháng (D-d, mm) LT2 10 12 10 8 LT4 16 13 14 12 LT7 17 13 9 8 LT10 9 11 6 9 LT12 8 8 9 7 LT13 9 8 7 7 Mẫu pH Mẫu pH 0,15% protein 4,12 1% saccharose 5,12 0,25% protein 4,15 2% saccharose 4,97 0,35% protein 4,13 3% saccharose 4,15
Kết quả Bảng 3.6 cho thầy rằng cùng một chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus plantarum nhưng thành phần môi trường dịch ép đậu lên men khác nhau thì khả năng lên men cũng có sự khác nhau. pH của dịch ép lên men giảm nhanh sau 48 giờ, ứng với các mẫu 0,35% protein và 3% đường saccharose. Mục tiêu của thí nghiệm này là lựa chọn được hàm lượng các chất thích hợp bổ sung vào dịch ép đậu lên men lactic sao cho pH giảm nhanh. Như vậy, để nước ép đậu lên men tốt cần bổ sung thêm dịch sữa đậu nành để hàm lượng protein trong dịch ép cuối cùng là 0,35%, lượng đường saccharose bổ sung là 3%.
3.4. KẾT QUẢ THĂM DÒ CÁC THÔNG SỐ pH, NHIỆT ĐỘ, THỜI GIAN KẾT TỦA PROTEIN SỮA ĐẬU NÀNH
3.4.1. Kết quả thăm dò pH kết tủa protein sữa đậu nành
a b e e c d a b e f d c 0 100 200 300 400 500 4 4.5 5 5.5 6 6.5 pH S ả n l ư ợ n g ( g ) 0 20 40 60 80 100 120 140 Đ ộ g e l (g .c m ) Sản lượng Độ gel
Hình 3.5. Mỗi quan hệ giữa pH lên sản lượng và độ gel đậu phụ
Nhận xét: kết quả thăm dò pH trên Hình 3.5 cho thấy rằng khi tăng pH từ 4 tới
5,5 sản lượng gel có xu hướng tăng đều, cụ thể tại pH = 4 sản lượng gel thu được là 314 ± 14, 012 g, pH = 4,5 thì sản lượng gel là 366,33 ± 19,858 g rồi tăng lên 416,67 ± 9,074 g tại pH = 5, sản lượng gel đạt cực đại 436,67 ± 16,503 g tại pH = 5,5. pH tiếp tục được tăng lên cho tới 6,5 nhưng sản lượng gel không tăng nữa mà có xu hướng giảm và giảm nhanh, tại pH = 6, sản lượng gel là 251,67 ± 15, 567 g, còn ở pH = 6,5 sản lượng gel giảm xuống còn 122,33 ± 14,189 g.
Độ bền gel có xu hướng tăng lên khi tăng pH từ 4 tới 5, tiếp tục tăng giá trị pH lên nhưng độ gel không tăng mà có xu hướng giảm và giảm nhanh khi tăng pH từ 6 lên 6,5. Sản lượng gel đạt giá trị cực đại là 117,76 g.cm tại pH = 5. Gel tạo thành tương đối yếu, độ bền gel chỉ đạt 34 g.cm tại pH = 6,5.
Sự khác nhau về giá trị trung bình giữa các nhóm thí nghiệm có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) (Phụ lục 28). Giá trị trung bình giữa các cặp thí nghiệm khác nhau có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên giữa cặp thí nghiệm tại pH = 5 và 5,5 sự khác nhau về sản lượng thu được không có ý nghĩa thống kê.
Giải thích: cơ chế tạo gel chính là dựa vào sự thay đổi mức độ ion hoá của các
phân tử protein khi thay đổi pH của dịch sữa đậu nành từ giá trị pH của môi trường dịch sữa tiến gần về quanh giá trị PI. pH được điều chỉnh gần tới điểm đẳng điện đã làm thay đổi mức độ ion hoá các phân tử protein. Lực đẩy giữa các mạch phân tử protein yếu dần và chúng có xu hướng tụ hợp với nhau tạo gel. Tuy nhiên chỉ khi tới điểm đẳng điện protein đậu nành, các phân tử protein mới bị trung hoà về điện và tụ hợp để tạo gel. Sản lượng gel thu được lớn hay nhỏ còn được đánh giá nhờ vào khả năng giữ nước của mạng lưới gel. Nhân tố quyết định tới khả năng giữ nước là các liên kết ngang được hình thành nhiều hay ít. Lượng liên kết ngang hình thành phụ thuộc vào loại protein, tỷ lệ giữa conglycinin và glycinin.
Tại giá trị pH = 5 ÷ 5,5 là điểm đẳng điện protein đậu nành, cùng một loại protein sản lượng gel thu được là lớn nhất. Khi pH tiến xa giá trị điểm đẳng điện thì sản lượng gel thu được thấp do cơ hộ tụ hợp các chuỗi protein không nhiều. Vẫn còn lực đẩy giữa các mạch protein này.
Các giá trị pH khác nhau độ bền của gel thu được cũng khác nhau là do mức độ ion hoá protein khác nhau, lượng các liên kết ngang hình thành khác nhau. Tại pH = 5 là điểm đẳng điện các liên kết ngang hình thành nhiều nhất.
Kết luận: pH = 5 được chọn để tiếp tục bố trí cho các thí nghiệm thăm dò về nhiệt độ và thời gian.
Sau thí nghiệm thăm dò, khoảng pH thích hợp để tiến hành tối ưu công đoạn kết tủa là từ 4 ÷ 6.
3.4.2. Kết quả thăm dò nhiệt độ kết tủa protein sữa đậu nành
Sau khi tiến hành bố trí thí nghiệm thăm dò khoảng nhiệt độ thích hợp cho công đoạn kết tủa protein sữa đậu nành thu được những kết quả như sau.
d d c b a d cd c b a 0 100 200 300 400 500 75 80 85 90 95
Nhiệt độ (0C)
S ả n l ư ợ ng (g ) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Đ ộ ge l (g .c m ) sản lượng độ gel
Hình 3.6. Mỗi quan hệ giữa nhiệt độ tới sản lượng và độ gel
Nhận xét: kết quả thăm dò vùng nhiệt độ được thể hiện trên Hình 3.6. Kết quả
trên cho thấy nhiệt độ là một nhân tố ảnh hưởng mạnh tới sản lượng gel và độ bền gel đậu phụ. Sản lượng gel thu được khá cao khi nhiệt độ kết tủa trong khoảng 80 ÷ 90oC. Sản lượng gel thu được là lớn nhất đạt 432,00 ± 23,605 g khi nhiệt độ kết tủa là 90oC. Nếu kết tủa protein sữa đậu nành tại các giá trị nhiệt độ 75oC hay 95oC thì sản lượng gel thu được tương đối thấp, lần lượt là 217,33 ± 20,841 g và 272,67 ± 45,622 g.
Độ bền gel có xu hướng tăng lên khi ta tăng nhiệt độ từ 75 ÷ 95oC. Trong miền khảo sát này, độ bền gel cao nhất là 140,33 ± 5,508 g.cm khi kết tủa protein sữa đậu nành tại nhiệt độ 95oC.
Sự khác nhau về giá trị trung bình giữa các nhóm thí nghiệm có ý nghĩa về mặt thống kê (p < 0,05) (Phụ lục 31). Khi so sánh sự khác nhau về các cặp giá trị trung bình, kết quả cho thấy rằng giữa 2 thí nghiệm tại nhiệt độ 85oC và 90oC khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê, có thể chọn một trong 2 giá trị cho bố trí thí nghiệm thăm dò pH.
Giải thích: nhiệt độ là một trong các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tạo gel của
protein, trước giai đoạn tương tác có trật tự giữa protein – protein và tập hợp phân tử thì cần phải có giai đoạn biến tính và giãn mạch xảy ra trước. Khi thực hiện quá trình gia nhiệt ở nhiệt độ cao chính là quá trình làm biến tính protein. Mặt khác nhiệt độ kết tủa cao làm tăng chuyển động nhiệt các phân tử protein có điều kiện xích lại gần nhau hơn thuận tiện cho việc kết tụ.
Nhiệt độ thấp thì liên kết hydro càng được tăng cường và củng cố vì vậy càng có nhiều điều kiện để tạo ra cầu hydro, liên kết hydro là liên kết yếu (8 ÷ 21 KJ), tạo ra một độ linh động nào đó giữa các phân tử với nhau nên gel tạo ra mềm. Do đó khi kết
tủa ở một nhiệt độ thích hợp gel tạo thành sẽ có chất lượng tốt. Nhưng khi vượt qua một nhiệt độ nào đó thì độ bền gel sẽ giảm. Nếu nhiệt độ kết tủa thấp thì quá trình ép định hình gel không kết dính. Vì vậy mà độ bền gel sẽ giảm. Nếu nhiệt độ kết tủa quá cao thì liên kết hydrogen bị đứt khả năng giữ nước gel cũng bị giảm, sản lượng gel thu được thấp hơn so với khi kết tủa protein ở một nhiệt độ thích hợp.
Kết luận: qua kết quả khảo sát chọn được vùng nhiệt độ cho quá trình tối ưu công đoạn kết tủa là 80 ÷ 90oC.
Giá trị nhiệt độ thích hợp đưa vào bố trí thí nghiệm thăm dò pH và thời gian là 90oC.
3.4.3. Kết quả thăm dò thời gian kết tủa protein sữa đậu nành
Hình 3.7. Mỗi quan hệ giữa thời gian tới sản lượng và độ gel đậu phụ
Nhận xét: yếu tố thời gian là một trong 3 yếu tố ảnh hưởng tới sản lượng gel và
độ bền gel của đậu phụ. Tuy nhiên, dựa vào kết quả thu được, thể hiện như trên Hình 3.7 cho thấy rằng thời gian ảnh hưởng không nhiều tới 2 hàm mục tiêu.
Khi tăng thời gian kết tủa từ 5 ÷ 15 phút sản lượng có xu hướng tăng, nhưng tăng ít. Sản lượng gel thu được là cao nhất đạt 429,33 ± 21,825 g khi thời gian kết tủa là 10 phút. Thời gian được tiếp tục tăng lên, nhưng sản lượng gel không tăng nữa mà giảm xuống nhẹ. Nếu đậu phụ được kết tủa trong vòng 25 phút thì sản lượng thu được chỉ đạt 283,67 ± 12,097 g.
Đồ thị Hình 3.7 đã chỉ ra rằng độ bền gel tăng khi tăng thời gian từ 5 đến 15