1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men
Các thực phẩm lên men được cho vào túi PE vô trùng (với tỷ lệ 25 g thực phẩm trong 225 ml nước muối sinh lý đã được tiệt trùng), đồng hoá thủ công bằng tay, sau đó cấy chuyển vào dịch ép đậu phụ, cấy chuyển nhiều lần. Ống nào có lên men lactic được sử dụng để phân lập vi khuẩn trên đĩa thạch MRS. Vi khuẩn lactic được sơ bộ định danh bằng quan sát hình thái trên tiêu bản nhuộm, và thử nghiệm catalase. Vi
khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính [7, 8, 9, 18, 34].
2. Đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn bằng phương pháp đo độ đục
Dựa trên cơ sở nếu cùng một môi trường và điều kiện nuôi cấy, chủng vi khuẩn nào phát triển mạnh, mật độ tế bào sẽ nhiều hơn, độ đục lớn hơn. Tốc độ sinh trưởng giữa các chủng được so sánh bằng phương pháp đo độ đục môi trường MRS lỏng lên men bởi các chủng lactic sau 24 giờ ở 37oC.
Độ đục được đo bằng máy đo độ đục (đục kế - turbidimeter) với các thang đo NTU theo tiêu chuẩn TCVN 6184 - 2008.
3. Khảo sát và chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic phát triển mạnh và có tính kháng khuẩn cao
Tính kháng khuẩn được kiểm tra bằng hai phương pháp là phương pháp cấy điểm và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [28]. Các chủng chỉ thị được phòng thí nghiệm hóa - vi sinh, trung tâm thực hành, Trường Đại học Nha Trang cung cấp. Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi kích thước bề dày vòng vô khuẩn rộng hơn 2 mm [1].
Phương pháp cấy điểm
Cả hai phương pháp cấy điểm và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đều có cùng một mục đích chung là kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic đã được lựa chọn. Tuy nhiên, phương pháp cấy điểm có thao tác dễ thực hiện và có độ nhạy cao hơn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Bên cạnh đó phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian và điều kiện nuôi ủ chủng kiểm nghiệm cũng như chủng chỉ thị. Do đó phương pháp này được thực hiện trước. Nhưng phương pháp này có một hạn chế là yếu tố kháng khuẩn có thể bị bất hoạt do một số chất trong môi trường, vì vậy cần phải tiến hành thêm phương pháp đục giếng để có kết luận đảm bảo về chủng có tính kháng khuẩn.
Các chủng vi khuẩn lactic sau khi phân lập sẽ được cấy thành từng điểm trên môi trường MRS, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, 48 giờ. Các đĩa này tiếp tục được phủ một lớp thạch TSA và cấy trang các chủng chị thị lên khi bề mặt thạch TSA vừa khô, rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC, thời gian 24 giờ, tiến hành đọc kết quả.
Phương pháp “khuếch tán qua giếng thạch”
Các chủng chỉ thị được hoạt hoá từ ống giống trên thạch TSA. Sau 24 giờ, những chủng này sẽ được pha loãng trong nước muối sinh lý đã hấp vô trùng. Các đĩa
thạch TSA khô được chuẩn bị sẵn, có chiều dày 6 mm và trang các chủng chị thị lên, tiếp theo dùng ống hút nhựa đã vô trùng tiến hành đục giếng đường kính 5 mm. Dịch MRS đã cấy các dòng vi khuẩn lactic trước đó 72 giờ, nuôi ở 37oC hoặc dịch ép đậu lên men lactic 72 giờ cùng điều kiện nhiệt độ, đem đi li tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 8.000 vòng trong 15 phút, thu lấy dịch trong, dùng dịch nổi này nhỏ vào các giếng đã đục sẵn. Kỹ thuật nhỏ dịch phải đảm bảo không làm loang, dịch vừa đầy bề mặt, lượng dịch nhỏ vào là 70 μl. Cuối cùng các đĩa được ủ ở ở 37oC.
Khả năng lên men dịch ép đậu
Các chủng vi khuẩn lactic được bổ sung vào môi trường dịch ép đậu rồi lên men, sau 48 giờ tiến hành đánh giá cảm quan và đo pH.
Khả năng lên men được đánh giá bằng cảm quan [14] và đo pH bằng máy đo pH theo tiêu chuẩn TCVN 6492 : 1999.
4. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn được
Chủng vi khuẩn tuyển chọn được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH.
Quá trình định danh được thực hiện bởi phòng xét nghiệm NK-BIOTEK (địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, P. Tân Hưng, Q.7, TP. HCM).