2.2.1. Cách tiếp cận
Protein trong dịch sữa đậu nành được tủa xuống ngoài cách sử dụng Ca2+ như thường gặp, có thể sử dụng pH thấp bằng các dịch lên men [40, 41, 42, 50, 51]. Đầu tiên, ủ dịch nước ép đậu với các thực phẩm lên men lactic, đánh giá khả năng lên men để có thể chọn được chủng thích hợp với môi trường này.
Bước tiếp theo là chọn các thông số thích hợp cho quá trình lên men lactic nước ép đậu, quá trình tủa protein, … từ đó đưa ra quy trình sản xuất hiệu quả. Sản phẩm thu được sẽ có thời gian bảo quản kéo dài hơn do khi lên men, axit lactic sinh ra đã làm giảm pH dịch lên men xuống thấp, ngoài ra vi khuẩn lactic sản sinh các chất kháng khuẩn khác nhau như H2O2, bacteriocin và một số chất hữu cơ khác có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh làm tăng tính an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm so với đậu phụ sản xuất thông thường [37, 44, 50]
2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men
Các thực phẩm lên men được cho vào túi PE vô trùng (với tỷ lệ 25 g thực phẩm trong 225 ml nước muối sinh lý đã được tiệt trùng), đồng hoá thủ công bằng tay, sau đó cấy chuyển vào dịch ép đậu phụ, cấy chuyển nhiều lần. Ống nào có lên men lactic được sử dụng để phân lập vi khuẩn trên đĩa thạch MRS. Vi khuẩn lactic được sơ bộ định danh bằng quan sát hình thái trên tiêu bản nhuộm, và thử nghiệm catalase. Vi
khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính [7, 8, 9, 18, 34].
2. Đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn bằng phương pháp đo độ đục
Dựa trên cơ sở nếu cùng một môi trường và điều kiện nuôi cấy, chủng vi khuẩn nào phát triển mạnh, mật độ tế bào sẽ nhiều hơn, độ đục lớn hơn. Tốc độ sinh trưởng giữa các chủng được so sánh bằng phương pháp đo độ đục môi trường MRS lỏng lên men bởi các chủng lactic sau 24 giờ ở 37oC.
Độ đục được đo bằng máy đo độ đục (đục kế - turbidimeter) với các thang đo NTU theo tiêu chuẩn TCVN 6184 - 2008.
3. Khảo sát và chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic phát triển mạnh và có tính kháng khuẩn cao
Tính kháng khuẩn được kiểm tra bằng hai phương pháp là phương pháp cấy điểm và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [28]. Các chủng chỉ thị được phòng thí nghiệm hóa - vi sinh, trung tâm thực hành, Trường Đại học Nha Trang cung cấp. Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi kích thước bề dày vòng vô khuẩn rộng hơn 2 mm [1].
Phương pháp cấy điểm
Cả hai phương pháp cấy điểm và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đều có cùng một mục đích chung là kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic đã được lựa chọn. Tuy nhiên, phương pháp cấy điểm có thao tác dễ thực hiện và có độ nhạy cao hơn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Bên cạnh đó phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian và điều kiện nuôi ủ chủng kiểm nghiệm cũng như chủng chỉ thị. Do đó phương pháp này được thực hiện trước. Nhưng phương pháp này có một hạn chế là yếu tố kháng khuẩn có thể bị bất hoạt do một số chất trong môi trường, vì vậy cần phải tiến hành thêm phương pháp đục giếng để có kết luận đảm bảo về chủng có tính kháng khuẩn.
Các chủng vi khuẩn lactic sau khi phân lập sẽ được cấy thành từng điểm trên môi trường MRS, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, 48 giờ. Các đĩa này tiếp tục được phủ một lớp thạch TSA và cấy trang các chủng chị thị lên khi bề mặt thạch TSA vừa khô, rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC, thời gian 24 giờ, tiến hành đọc kết quả.
Phương pháp “khuếch tán qua giếng thạch”
Các chủng chỉ thị được hoạt hoá từ ống giống trên thạch TSA. Sau 24 giờ, những chủng này sẽ được pha loãng trong nước muối sinh lý đã hấp vô trùng. Các đĩa
thạch TSA khô được chuẩn bị sẵn, có chiều dày 6 mm và trang các chủng chị thị lên, tiếp theo dùng ống hút nhựa đã vô trùng tiến hành đục giếng đường kính 5 mm. Dịch MRS đã cấy các dòng vi khuẩn lactic trước đó 72 giờ, nuôi ở 37oC hoặc dịch ép đậu lên men lactic 72 giờ cùng điều kiện nhiệt độ, đem đi li tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 8.000 vòng trong 15 phút, thu lấy dịch trong, dùng dịch nổi này nhỏ vào các giếng đã đục sẵn. Kỹ thuật nhỏ dịch phải đảm bảo không làm loang, dịch vừa đầy bề mặt, lượng dịch nhỏ vào là 70 μl. Cuối cùng các đĩa được ủ ở ở 37oC.
Khả năng lên men dịch ép đậu
Các chủng vi khuẩn lactic được bổ sung vào môi trường dịch ép đậu rồi lên men, sau 48 giờ tiến hành đánh giá cảm quan và đo pH.
Khả năng lên men được đánh giá bằng cảm quan [14] và đo pH bằng máy đo pH theo tiêu chuẩn TCVN 6492 : 1999.
4. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn được
Chủng vi khuẩn tuyển chọn được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH.
Quá trình định danh được thực hiện bởi phòng xét nghiệm NK-BIOTEK (địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, P. Tân Hưng, Q.7, TP. HCM).
2.2.3. Bố trí thí nghiệm
1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
Hình 2.1. Thí nghiệm tuyển lựa chủng vi khuẩn lactic
Nước ép đậu phụ Thực phẩm lên men lactic Cấy chuyển nhiều lần Dịch lên men
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic phù hợp
Tiêu chuẩn để chọn vi khuẩn :
Vi khuẩn lactic
Thích hợp với môi trường chứa nước ép đậu
Có khả năng kháng khuẩn
2. Sơ đồ quy trình sản xuất đậu phụ bằng dịch ép đậu lên men lactic dự kiến
Quy trình sản xuất đậu phụ bằng nước ép đậu lên men lactic dự kiến được dựa trên quy trình sản xuất đậu phụ bằng nước chua tự nhiên [4]. Tuy nhiên trong quy trình có thay đổi một số thông số và tác nhân kết tủa đề phù hợp với điều kiện thí nghiệm và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
Hình 2.2. Quy trình sản xuất đậu phụ bằng dịch ép đậu lên men lactic dự kiến
Bã Lọc thô Lọc tinh Ngâm 8 giờ Nước/ đậu = 1/6 Ngâm Đậu nành Xay Ép khuôn Kết tủa Sản phẩm Nước ép đậu
lên men lactic
Đun sôi 10 phút
3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Xay 8 giờ Đậu nành Ngâm Xay Lọc thô Lọc tinh Dịch sữa đậu nành Đun sôi Kết tủa Chắt nước Ép khuôn Sản phẩm Đậu /nước = 1/6 Bã 10 phút Nước chắt pH = 4÷6,5 = 5÷25 phút To = 75÷95oC Tỷ lệ thạch cao = 3,4÷4,6%
Nước ép đậu lên men
lactic
Xác định hàm lượng protein
tổng số Saccharose 1-3% Protein 0,15- 0,35%
4. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng thạch cao kết tủa protein đậu nành
Sản xuất đậu phụ có chất lượng tốt liên quan nhiều yếu tố. Đối với sản xuất đậu phụ bằng thạch cao, hàm lượng thạch cao rất quan trọng. Để có thể so sánh với các phương pháp sản xuất đậu phụ khác nhau cần phải xác định hàm lượng thạch cao thích hợp. Trong khuôn khổ của đề tài sử dụng các kết quả nghiên cứu trước. Tuy nhiên tỷ lệ thạch cao sử dụng có sự khác nhau. Tiến hành khảo sát lại tỷ lệ thạch cao cần sử dụng kết tủa protein đậu nành.
Hình 2.4. Thí nghiệm xác định hàm lượng thạch cao kết tủa protein sữa đậu nành
Dịch sữa đậu nành Kết tủa = 5 phút To = 90oC Ép khuôn 3,4% 4% 4,6% Thạch cao Sản phẩm Cân sản lượng, đo độ bền gel Đánh giá cảm quan Hàm lượng thạch cao thích hợp (b%) Đun sôi
5. Xác định thành phần dịch lên men lactic
Nước ép đậu phụ còn chứa một lượng protein nhất định, (khoảng 0,06% - số liệu thực nghiệm), để tận thu và giảm ô nhiễm môi trường đưa nước ép này vào làm thí nghiệm. Tiến hành bố trí các thí nghiệm bổ sung thêm đường saccharose và dịch sữa đậu nành. Bố trí thí nghiệm theo phương pháp cổ điển. Lượng sữa đậu nành được bổ sung thêm để đạt được hàm lượng protein cuối cùng là 0,15; 0,25; 0,35%, với cùng một nồng độ saccharose là 2%. Sơ đồ thí nghiệm được thể hiện như trên Hình 2.5.
Nước ép đậu phụ sau khi bổ sung thêm các thành phần, có pH 6,2 ÷ 6,5 được đem đi lên men ở nhiệt độ phòng, trong vòng 48 giờ. Mẫu lên men tốt được xác định bằng cách đánh giá cảm quan và đo pH dịch sau lên men.
Các thí nghiệm được bố trí tương tự với hàm lượng đường bổ sung lần lượt là 1, 2, 3%, với nồng độ protein thích hợp chọn được ở trên. Tóm tắt thí nghiệm như sơ đồ Hình 2.6.
Hình 2.5. Thí nghiệm xác định nồng độ protein cho dịch lên men lactic
0,35% Dịch để lên men
(pH = 6,2÷6,5)
Nước ép đậu phụ đậu nành Dịch sữa 10% Đường
saccharose (2%)
Lên men ở nhiệt độ phòng 48 giờ
Đo pH và quan sát cảm quan
Chọn được nồng độ protein (a%)
Nồng độ protein 0,15% 0,25%
Hình 2.6. Thí nghiệm xác định hàm lượng đường bổ sung vào dịch ép đậu
6. Xác định điều kiện kết tủa protein sữa đậu nành (pH, nhiệt độ, thời gian) trong sản xuất đậu phụ bằng nước ép đậu lên men lactic
Trong đề tài này xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Trước khi sử dụng quy hoạch thực nghiệm cần xác định các giá trị biên của miền thí nghiệm.
a. Thăm dò khoảng pH kết tủa protein đậu nành
Mục đích: thăm dò khoảng pH thích hợp kết tủa protein đậu nành, việc thăm dò dựa trên cơ sở sau: trong đậu nành globulin chiếm 85 ÷ 95% . Globulin có điểm đẳng điện là khoảng 5,5. Theo tài liệu các quá trình công nghệ cơ bản trong thực phẩm thì pH kết tủa protein đậu nành là 4,6 ÷ 4,7. Vì vậy tiến hành thăm dò pH từ 4 ÷ 6,5. Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ Hình 2.7.
Dịch để lên men (pH = 6,2÷6,5) Nước ép đậu phụ Dịch sữa
đậu nành a%
Lên men ở nhiệt độ phòng 48 giờ
Đo pH và đánh giá cảm quan
Chọn được nồng độ đường thích hợp
Đường saccharose
Hình 2.7. Thí nghiệm thăm dò khoảng pH
b. Thăm dò khoảng nhiệt độ kết tủa protein sữa đậu nành
Mục đích: chọn được khoảng nhiệt độ thích hợp kết tủa sữa đậu. Tùy theo tác nhân kết tủa mà bố trí thí nghiệm trong khoảng nhiệt độ thích hợp. Theo quy trình sản xuất truyền thống sử dụng nước chua tự nhiên thì nhiệt độ kết tủa là 95 ÷ 97oC. Nếu sử dụng gói men đậu thì nhiệt độ kết tủa là 80oC. Vùng nhiệt độ được chọn để làm thí nghiệm là trong khoảng 75 ÷ 95oC. Thí nghiệm được bố trí như trên Hình 2.8.
4 4,5 5 5,5 6 6,5 Dịch sữa đậu nành Sản phẩm Ép khuôn Kết tủa = 10 phút To = 90oC Chọn khoảng pH thích hợp
Đo độ bền gel và cân khối lượng gel Đánh giá cảm quan pH kết tủa
Hình 2.8. Thí nghiệm thăm dò khoảng nhiệt độ kết tủa protein đậu nành
Đun sôi Kết tủa Ép khuôn Sản phẩm Chọn khoảng nhiệt độ thích hợp Đo độ bền gel
Cân khối lượng gel
Đánh giá cảm quan 95oC 80oC 75oC 85oC 90oC Nhiệt độ kết tủa (oC) pH = pH thích hợp chọn từ TN 7a; = 10 phút Dịch sữa đậu nành
c. Thăm dò thời gian kết tủa protein sữa đậu nành
Mục đích: xác định được thời gian kết tủa protein đậu nành cũng như đánh giá mức độ ảnh hưởng của yếu tố thời gian lên sản lượng và độ bền gel đậu phụ. Các thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ Hình 2.9.
Hình 2.9. Thí nghiệm xác định thời gian kết tủa protein đậu nành
8. Tối ưu hoá quy hoạch thực nghiệm
Tối ưu hoá công đoạn kết tủa được tóm tắt như sơ đồ sau:
Công đoạn kết tủa
Độ gel Y2 Sản lượng Y1 Z2= pH Z1= Nhiệt độ Z3= Thời gian 5 Kết tủa Dịch sữa đậu nành pH = chọn ở TN “7a” To = chọn ở TN “7b”
Đánh giá khả năng đông tụ
Ép khuôn
Sản phẩm Xác định thời
gian thích hợp 25
10 15 20
Cân sản lượng, đo độ gel Đánh giá cảm quan Thời gian kết tủa
(phút)
1. Bài toán tối ưu hoá
Xác định nhiệt độ, thời gian, pH kết tủa protein sữa đậu nành để sản lượng đậu phụ và độ gel thu được là lớn nhất, đồng thời chất lượng cảm quan của đậu phụ là tốt. Sau khi tiến hành các thí nghiệm thăm dò, đã chọn được các giá trị biên của từng thông số kỹ thuật như sau:
Z1 = 4 ÷ 6 Z2 = 80 ÷ 90oC Z3 = 5 ÷ 15 phút
Phương án quy hoạch thực nghiệm: phương pháp bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm Box – Behnken. Với 3 nhân tố pH, nhiệt độ, thời gian và 15 thí nghiệm được chọn lựa để tối ưu hoá. Phương trình tổng quát theo thiết kế thí nghiệm này là: Trong đó: bo: là hệ số tự do bi: là hệ số bậc 1 bii: là hệ số bậc 2 bij: hệ số của từng cặp yếu tố. Xi, Xii, Xij: là các biến Y : là hàm mục tiêu
2. Thiết kế thí nghiệm theo quy hoạch Box-Behnken
Bảng 2.1. Ma trận thí nghiệm với biến thực
STT pH Z1 Nhiệt độ (oC) Z2 Thời gian (phút) Z3 Y1 (g) Y2(g.cm) 1 6 85 5 2 4 85 15 3 6 80 10 4 5 90 5 5 5 80 5 6 4 85 5 X b X b X b b Y i i ii ii2 ij ij 0
7 4 90 10 8 6 90 10 9 5 85 10 10 5 80 15 11 6 85 15 12 5 85 10 13 4 80 10 14 5 85 10 15 5 90 15
Bảng 2.2. Ma trận thí nghiệm với các biến mã
STT X1 X2 X3 Y1 Y2 1 1 0 -1 2 -1 0 1 3 1 -1 0 4 0 1 -1 5 0 -1 -1 6 -1 0 -1 7 -1 1 0 8 1 1 0 9 0 0 0 10 0 -1 1 11 1 0 1 12 0 0 0 13 -1 -1 0 14 0 0 0 15 0 1 1
9. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả sản xuất
1. Bố trí thí nghiệm xác định lượng protein tổng số trong đậu phụ sản xuất bằng thạch
cao
Mục đích: nhằm xác định được hiệu suất thu hồi protein trong đậu phụ sản xuất bằng thạch cao. Sau đó đem so sánh với hiệu suất thu hồi protein trong đậu phụ sản xuất bằng dịch ép đậu lên men lactic. Cách xác định hàm lượng protein tổng số được trình bày ở Phụ lục 1. Sau khi bố trí thí nghiệm xác định được hàm lượng thạch cao thích hợp để kết tủa protein sữa đậu nành. Tiến hành sản xuất đậu phụ với thông số kỹ thuật này rồi đem mẫu đi xác định hàm lượng protein và thí nghiệm được bố trí như trên Hình 2.10.
Hình 2.10. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein tổng số trong đậu phụ sản xuất bằng thạch cao
2. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein thu hồi trong đậu phụ sản xuất bằng
nước ép đậu lên men lactic
Mục đích: thí nghiệm này được bố trí nhằm đánh giá được khả năng thu hồi protein khi sử dụng tác nhân kết tủa là nước ép đậu lên men lactic.
Sau khi ép khuôn thu được nước trong và bánh đậu phụ. Từ nước trong chuẩn bị 3 mẫu, mỗi mẫu 10 ml, đi vô cơ hóa rồi xác định protein. Từ bánh đậu phụ, cắt lấy
Kết tủa Tỷ lệ thạch cao sử dụng = b% = 10 phút To = 90oC Ép khuôn Nước ép Sản phẩm Xác định hàm lượng protein Dịch sữa đậu nành Đun sôi = 10 phút Thạch cao
miếng nhỏ nghiền nhuyễn, sau đó cân 3 mẫu, mỗi mẫu khoảng 0,5 g (nhằm rút ngắn thời gian vô cơ). Phương pháp xác định protein tổng số được trình bày ở Phụ lục 1. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein được bố trí như trên Hình 2.11.
Hình 2.11. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein trong đậu phụ sản xuất bằng