1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
Hình 2.1. Thí nghiệm tuyển lựa chủng vi khuẩn lactic
Nước ép đậu phụ Thực phẩm lên men lactic Cấy chuyển nhiều lần Dịch lên men
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic phù hợp
Tiêu chuẩn để chọn vi khuẩn :
Vi khuẩn lactic
Thích hợp với môi trường chứa nước ép đậu
Có khả năng kháng khuẩn
2. Sơ đồ quy trình sản xuất đậu phụ bằng dịch ép đậu lên men lactic dự kiến
Quy trình sản xuất đậu phụ bằng nước ép đậu lên men lactic dự kiến được dựa trên quy trình sản xuất đậu phụ bằng nước chua tự nhiên [4]. Tuy nhiên trong quy trình có thay đổi một số thông số và tác nhân kết tủa đề phù hợp với điều kiện thí nghiệm và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
Hình 2.2. Quy trình sản xuất đậu phụ bằng dịch ép đậu lên men lactic dự kiến
Bã Lọc thô Lọc tinh Ngâm 8 giờ Nước/ đậu = 1/6 Ngâm Đậu nành Xay Ép khuôn Kết tủa Sản phẩm Nước ép đậu
lên men lactic
Đun sôi 10 phút
3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Xay 8 giờ Đậu nành Ngâm Xay Lọc thô Lọc tinh Dịch sữa đậu nành Đun sôi Kết tủa Chắt nước Ép khuôn Sản phẩm Đậu /nước = 1/6 Bã 10 phút Nước chắt pH = 4÷6,5 = 5÷25 phút To = 75÷95oC Tỷ lệ thạch cao = 3,4÷4,6%
Nước ép đậu lên men
lactic
Xác định hàm lượng protein
tổng số Saccharose 1-3% Protein 0,15- 0,35%
4. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng thạch cao kết tủa protein đậu nành
Sản xuất đậu phụ có chất lượng tốt liên quan nhiều yếu tố. Đối với sản xuất đậu phụ bằng thạch cao, hàm lượng thạch cao rất quan trọng. Để có thể so sánh với các phương pháp sản xuất đậu phụ khác nhau cần phải xác định hàm lượng thạch cao thích hợp. Trong khuôn khổ của đề tài sử dụng các kết quả nghiên cứu trước. Tuy nhiên tỷ lệ thạch cao sử dụng có sự khác nhau. Tiến hành khảo sát lại tỷ lệ thạch cao cần sử dụng kết tủa protein đậu nành.
Hình 2.4. Thí nghiệm xác định hàm lượng thạch cao kết tủa protein sữa đậu nành
Dịch sữa đậu nành Kết tủa = 5 phút To = 90oC Ép khuôn 3,4% 4% 4,6% Thạch cao Sản phẩm Cân sản lượng, đo độ bền gel Đánh giá cảm quan Hàm lượng thạch cao thích hợp (b%) Đun sôi
5. Xác định thành phần dịch lên men lactic
Nước ép đậu phụ còn chứa một lượng protein nhất định, (khoảng 0,06% - số liệu thực nghiệm), để tận thu và giảm ô nhiễm môi trường đưa nước ép này vào làm thí nghiệm. Tiến hành bố trí các thí nghiệm bổ sung thêm đường saccharose và dịch sữa đậu nành. Bố trí thí nghiệm theo phương pháp cổ điển. Lượng sữa đậu nành được bổ sung thêm để đạt được hàm lượng protein cuối cùng là 0,15; 0,25; 0,35%, với cùng một nồng độ saccharose là 2%. Sơ đồ thí nghiệm được thể hiện như trên Hình 2.5.
Nước ép đậu phụ sau khi bổ sung thêm các thành phần, có pH 6,2 ÷ 6,5 được đem đi lên men ở nhiệt độ phòng, trong vòng 48 giờ. Mẫu lên men tốt được xác định bằng cách đánh giá cảm quan và đo pH dịch sau lên men.
Các thí nghiệm được bố trí tương tự với hàm lượng đường bổ sung lần lượt là 1, 2, 3%, với nồng độ protein thích hợp chọn được ở trên. Tóm tắt thí nghiệm như sơ đồ Hình 2.6.
Hình 2.5. Thí nghiệm xác định nồng độ protein cho dịch lên men lactic
0,35% Dịch để lên men
(pH = 6,2÷6,5)
Nước ép đậu phụ đậu nành Dịch sữa 10% Đường
saccharose (2%)
Lên men ở nhiệt độ phòng 48 giờ
Đo pH và quan sát cảm quan
Chọn được nồng độ protein (a%)
Nồng độ protein 0,15% 0,25%
Hình 2.6. Thí nghiệm xác định hàm lượng đường bổ sung vào dịch ép đậu
6. Xác định điều kiện kết tủa protein sữa đậu nành (pH, nhiệt độ, thời gian) trong sản xuất đậu phụ bằng nước ép đậu lên men lactic
Trong đề tài này xác định bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. Trước khi sử dụng quy hoạch thực nghiệm cần xác định các giá trị biên của miền thí nghiệm.
a. Thăm dò khoảng pH kết tủa protein đậu nành
Mục đích: thăm dò khoảng pH thích hợp kết tủa protein đậu nành, việc thăm dò dựa trên cơ sở sau: trong đậu nành globulin chiếm 85 ÷ 95% . Globulin có điểm đẳng điện là khoảng 5,5. Theo tài liệu các quá trình công nghệ cơ bản trong thực phẩm thì pH kết tủa protein đậu nành là 4,6 ÷ 4,7. Vì vậy tiến hành thăm dò pH từ 4 ÷ 6,5. Thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ Hình 2.7.
Dịch để lên men (pH = 6,2÷6,5) Nước ép đậu phụ Dịch sữa
đậu nành a%
Lên men ở nhiệt độ phòng 48 giờ
Đo pH và đánh giá cảm quan
Chọn được nồng độ đường thích hợp
Đường saccharose
Hình 2.7. Thí nghiệm thăm dò khoảng pH
b. Thăm dò khoảng nhiệt độ kết tủa protein sữa đậu nành
Mục đích: chọn được khoảng nhiệt độ thích hợp kết tủa sữa đậu. Tùy theo tác nhân kết tủa mà bố trí thí nghiệm trong khoảng nhiệt độ thích hợp. Theo quy trình sản xuất truyền thống sử dụng nước chua tự nhiên thì nhiệt độ kết tủa là 95 ÷ 97oC. Nếu sử dụng gói men đậu thì nhiệt độ kết tủa là 80oC. Vùng nhiệt độ được chọn để làm thí nghiệm là trong khoảng 75 ÷ 95oC. Thí nghiệm được bố trí như trên Hình 2.8.
4 4,5 5 5,5 6 6,5 Dịch sữa đậu nành Sản phẩm Ép khuôn Kết tủa = 10 phút To = 90oC Chọn khoảng pH thích hợp
Đo độ bền gel và cân khối lượng gel Đánh giá cảm quan pH kết tủa
Hình 2.8. Thí nghiệm thăm dò khoảng nhiệt độ kết tủa protein đậu nành
Đun sôi Kết tủa Ép khuôn Sản phẩm Chọn khoảng nhiệt độ thích hợp Đo độ bền gel
Cân khối lượng gel
Đánh giá cảm quan 95oC 80oC 75oC 85oC 90oC Nhiệt độ kết tủa (oC) pH = pH thích hợp chọn từ TN 7a; = 10 phút Dịch sữa đậu nành
c. Thăm dò thời gian kết tủa protein sữa đậu nành
Mục đích: xác định được thời gian kết tủa protein đậu nành cũng như đánh giá mức độ ảnh hưởng của yếu tố thời gian lên sản lượng và độ bền gel đậu phụ. Các thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ Hình 2.9.
Hình 2.9. Thí nghiệm xác định thời gian kết tủa protein đậu nành
8. Tối ưu hoá quy hoạch thực nghiệm
Tối ưu hoá công đoạn kết tủa được tóm tắt như sơ đồ sau:
Công đoạn kết tủa
Độ gel Y2 Sản lượng Y1 Z2= pH Z1= Nhiệt độ Z3= Thời gian 5 Kết tủa Dịch sữa đậu nành pH = chọn ở TN “7a” To = chọn ở TN “7b”
Đánh giá khả năng đông tụ
Ép khuôn
Sản phẩm Xác định thời
gian thích hợp 25
10 15 20
Cân sản lượng, đo độ gel Đánh giá cảm quan Thời gian kết tủa
(phút)
1. Bài toán tối ưu hoá
Xác định nhiệt độ, thời gian, pH kết tủa protein sữa đậu nành để sản lượng đậu phụ và độ gel thu được là lớn nhất, đồng thời chất lượng cảm quan của đậu phụ là tốt. Sau khi tiến hành các thí nghiệm thăm dò, đã chọn được các giá trị biên của từng thông số kỹ thuật như sau:
Z1 = 4 ÷ 6 Z2 = 80 ÷ 90oC Z3 = 5 ÷ 15 phút
Phương án quy hoạch thực nghiệm: phương pháp bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm Box – Behnken. Với 3 nhân tố pH, nhiệt độ, thời gian và 15 thí nghiệm được chọn lựa để tối ưu hoá. Phương trình tổng quát theo thiết kế thí nghiệm này là: Trong đó: bo: là hệ số tự do bi: là hệ số bậc 1 bii: là hệ số bậc 2 bij: hệ số của từng cặp yếu tố. Xi, Xii, Xij: là các biến Y : là hàm mục tiêu
2. Thiết kế thí nghiệm theo quy hoạch Box-Behnken
Bảng 2.1. Ma trận thí nghiệm với biến thực
STT pH Z1 Nhiệt độ (oC) Z2 Thời gian (phút) Z3 Y1 (g) Y2(g.cm) 1 6 85 5 2 4 85 15 3 6 80 10 4 5 90 5 5 5 80 5 6 4 85 5 X b X b X b b Y i i ii ii2 ij ij 0
7 4 90 10 8 6 90 10 9 5 85 10 10 5 80 15 11 6 85 15 12 5 85 10 13 4 80 10 14 5 85 10 15 5 90 15
Bảng 2.2. Ma trận thí nghiệm với các biến mã
STT X1 X2 X3 Y1 Y2 1 1 0 -1 2 -1 0 1 3 1 -1 0 4 0 1 -1 5 0 -1 -1 6 -1 0 -1 7 -1 1 0 8 1 1 0 9 0 0 0 10 0 -1 1 11 1 0 1 12 0 0 0 13 -1 -1 0 14 0 0 0 15 0 1 1
9. Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả sản xuất
1. Bố trí thí nghiệm xác định lượng protein tổng số trong đậu phụ sản xuất bằng thạch
cao
Mục đích: nhằm xác định được hiệu suất thu hồi protein trong đậu phụ sản xuất bằng thạch cao. Sau đó đem so sánh với hiệu suất thu hồi protein trong đậu phụ sản xuất bằng dịch ép đậu lên men lactic. Cách xác định hàm lượng protein tổng số được trình bày ở Phụ lục 1. Sau khi bố trí thí nghiệm xác định được hàm lượng thạch cao thích hợp để kết tủa protein sữa đậu nành. Tiến hành sản xuất đậu phụ với thông số kỹ thuật này rồi đem mẫu đi xác định hàm lượng protein và thí nghiệm được bố trí như trên Hình 2.10.
Hình 2.10. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein tổng số trong đậu phụ sản xuất bằng thạch cao
2. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein thu hồi trong đậu phụ sản xuất bằng
nước ép đậu lên men lactic
Mục đích: thí nghiệm này được bố trí nhằm đánh giá được khả năng thu hồi protein khi sử dụng tác nhân kết tủa là nước ép đậu lên men lactic.
Sau khi ép khuôn thu được nước trong và bánh đậu phụ. Từ nước trong chuẩn bị 3 mẫu, mỗi mẫu 10 ml, đi vô cơ hóa rồi xác định protein. Từ bánh đậu phụ, cắt lấy
Kết tủa Tỷ lệ thạch cao sử dụng = b% = 10 phút To = 90oC Ép khuôn Nước ép Sản phẩm Xác định hàm lượng protein Dịch sữa đậu nành Đun sôi = 10 phút Thạch cao
miếng nhỏ nghiền nhuyễn, sau đó cân 3 mẫu, mỗi mẫu khoảng 0,5 g (nhằm rút ngắn thời gian vô cơ). Phương pháp xác định protein tổng số được trình bày ở Phụ lục 1. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein được bố trí như trên Hình 2.11.
Hình 2.11. Thí nghiệm xác định hàm lượng protein trong đậu phụ sản xuất bằng nước ép đậu lên men lactic
3. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian bảo quản của sản phẩm đậu phụ
Thời gian bảo quản của sản phẩm đậu phụ sản xuất bằng nước ép đậu lên men lactic được xác định và so sánh với mẫu đậu phụ sản xuất bằng thạch cao dựa vào nhiều yếu tố như: biến đổi của vi sinh vật và cảm quan sản phẩm trong thời gian bảo quản.
- Khi bảo quản ở nhiệt độ thường, thời gian sử dụng của sản phẩm được xác định thông qua đánh giá cảm quan hai mẫu đậu phụ, ở một điều kiện nhiệt độ bảo quản giống nhau
- Khi bảo quản ở nhiệt độ lạnh, yếu tố chính để xác định thời gian bảo quản đó là sự biến đổi hàm lượng vi sinh vật có trong mẫu đậu phụ.
a. Thí nghiệm định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí
Mục đích: để đánh giá được mức độ vệ sinh trong chế biến và bảo quản. Đồng thời đánh giá được tính kháng khuẩn của đậu sản xuất bằng nước ép đậu lên men lactic. Hai mẫu thí nghiệm được tiến hành song song là mẫu đậu phụ sản xuất bằng
Dịch sữa đậu nành Đun sôi = 10 phút Sản phẩm Kết tủa Ép khuôn pH = chọn từ TN “7a” To = chọn từ TN “7b” = chọn từ TN “7c” Xác định hàm lượng protein Nước ép Nước ép đậu lên men lactic
nước ép đậu lên men lactic và mẫu đậu sản xuất bằng thạch cao. Phương pháp định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí được quy định theo TCVN 5165 - 90 (Phụ lục 2.1). Quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí được tóm tắt như Hình 2.12.
Hình 2.12. Quy trình định lượng tổng số vi khuẩn hiếu khí b. Phân tích định tính Salmonella trong mẫu đậu phụ
Mục đích: đánh giá được mức độ vệ sinh trong quá trình sản xuất đậu phụ
Phương pháp định tính Salmonella được quy định theo TCVN 4829 : 2005 (Phụ
lục 2.4)
Tóm tắt quy trình phân tích định tính Salmonella được thể hiện trên Hình 2.13. Từ các nồng độ pha loãng trên, cấy chuyển 1 ml
mẫu vào đĩa petri vô trùng (mỗi nồng độ cấy 2 đĩa) Pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3…
Đếm khuẩn lạc mọc trên các đĩa
Rót vào mỗi đĩa 10-15 ml môi trường PCA đã được làm nguội tới 45oC, lắc cho mẫu phân tán đều vào
môi trường, ủ ở 37oC trong vòng 24 giờ
Tính kết quả: tổng số vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu (CFU/g)
Chuẩn bị mẫu: cân 25 g đậu phụ + 225 ml nước muối sinh lý, đồng nhất mẫu
Hình 2.13. Quy trình phân tích định tính Salmonella c. Xác định Coliform và Fecal coliform
Mục đích: để đánh giá được mức độ vệ sinh của nước cũng như điều kiện vệ sinh trong quá trình chế biến thực phẩm. Đánh giá ô nhiễm phân của nguồn nước... và theo dõi sự biến động của hai nhóm vi khuẩn này ngay từ khi mới sản xuất và trong quá trình bảo quản. Tương tự như các chỉ tiêu vi sinh vật khác. Tiến hành bố trí thí nghiệm với 2 mẫu đậu phụ. Phương pháp định lượng Coliforms và Fecal coliform được quy định theo TCVN 4882 : 2007 (Phụ lục 2.2).
Tóm tắt quy trình xác định Coliform và Fecal coliform như sơ đồ Hình 2.14. Chuẩn bị mẫu: cân 25 g đậu phụ + 225 ml dung
dịch BPW, đồng nhất mẫu
Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RV
Cấy ria trên môi trường chọn lọc (XLD)
Chọn khuẩn lạc đặc trưng để test sinh hóa
Kết luận Salmonella dương tính hay âm tính trong 25 gam mẫu
(Ủ ở 35oC, 24 giờ)
(Ủ ở 42oC, 24 giờ)
Hình 2.14. Quy trình định lượng Coliform và Fecal coliform d. Thí nghiệm định lượng Staphylococcus aureus
Mục đích: để đánh giá được điều kiện vệ sinh và quá trình kiểm soát nhiệt độ trong quá trình chế biến. Đồng thời theo dõi sự thay đổi của chỉ tiêu vi sinh này trong mẫu đậu phụ sản xuất bằng nước ép đậu lên men lactic. Tiến hành thí nghiệm xác định đối với mẫu đậu sản xuất bằng nước ép đậu lên men lactic và mẫu đậu phụ sản xuất
Xác định các ống dương tính (đục, sinh hơi)
Tra bảng Mac-Crandy xác định coliform tổng số (MPN/g)
Cấy ống dương tính vào canh EC, mối ống chứa 5 ml EC
Xác định ống dương tính (đục, sinh hơi)
Tra bảng Mac – Crandy, xác định Fecal coliform (MPN/g)
(Ủ ở 45oC, 24 giờ)
Chuẩn bị mẫu: cân 25 g đậu phụ + 225 ml dung dịch đệm phosphat hoặc nước muối sinh lý, đồng nhất mẫu
Pha loãng mẫu để có các nồng độ 10-2, 10-3, …
Chuyển 1ml mẫu 10-1,10-2, 10-3 vào các ống nghiệm 10 ml LSB, mỗi mẫu cấy vào 3 ống nghiệm.
bằng thạch cao khi mới sản xuất và trong quá trình bảo quản. Phương pháp định lượng
S.aureus theo TCVN 4830-1 : 2005 (Phụ lục 2.3). Quy trình định lượng S.aureus được
thể hiện trên Hình 2.15.
Hình 2.15. Quy trình định lượng S. aureus
Cấy 1 ml mẫu vào ống chứa 10 ml GCB (mỗi nồng độ cấy 3 ống lặp lại)
Ủ ở 37oC / 24 giờ
Chọn những ống đục (+) cấy ria trên môi trường thạch BP
Ủ ở 37oC / 24 giờ
Pha loãng mẫu để có các độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3 Chuẩn bị mẫu: cân 25 g đậu phụ + 225 ml nước muối sinh lý,
đồng nhất mẫu
Ghi nhận số ống dương tính với S. aureus (Manitol(+) và Coagulase (+))
Tra bảng Mac – Crandy, xác định số lượng
S. aureus (MPN/g)
Chọn khuẩn lạc đặc trưng để thực hiện test sinh hoá (Manitol và Coagulase)
e. Đánh giá cảm quan sản phẩm theo phương pháp cho điểm TCVN 3215 - 79