SỮA ĐẬU NÀNH
1.7.1. Cơ chế hình thành gel protein sữa đậu nành [53]
Sự hình thành gel protein là một bước quan trọng để tạo ra các sản phẩm thực phẩm có cấu trúc mong muốn. Quá trình biến tính nhiệt và theo sau là sự sắp xếp trật tự rồi đến sự tạo gel là các bước quan trọng để đảm bảo tất cả protein được phân tán vào trong mạng lưới gel.
Trong sản xuất đậu phụ quá trình tạo gel của protein đậu nành bao gồm biến tính nhiệt protein sữa đậu nành, sau đó là quá trình sắp xếp trật tự, tạo gel để chuyển thành đậu phụ.
Mục đích của biến tính nhiệt là giúp cho mạch protein được giãn ra. Thay vì ban đầu protein có cấu trúc nhỏ gọn thì sau khi gia nhiệt cấu trúc này được mở bung ra, trở nên khuếch tán và cấu trúc bên trong của các phân tử protein được lộ ra ngoài. Ví dụ như các nhóm chức –SH, phần kỵ nước, nhóm carbonyl, các nhóm amine của liên kết peptide và nhóm amide của chuỗi bên trở nên được lộ ra. Chính những nhóm chức này ảnh hưởng trực tiếp tới cấu trúc mạng lưới.
Sau khi phân ly rồi tập hợp lại trong suốt quá trình biến tính nhiệt các phân tử protein chuyển thành dạng sợi. Sự tương tác của các phân tử protein, các sợi theo một trật tự nhất định tạo thành mạng lưới không gian ba chiều.
Cơ chế hình thành gel protein của sữa đậu nành được quyết định chủ yếu là do nhiệt độ và gồm hai quá trình chính là phân ly và tập hợp. Tuy nhiên giữa glycinin và
conglycinin cơ chế tạo gel là khác nhau. Quá trình hình thành gel trong sản xuất đậu phụ bị ảnh hưởng bởi cả hai loại phân đoạn glycinin và conglycinin. Nếu tỷ lệ glycinin cao hơn conglycinin thì gel đậu phụ hình thành cứng hơn.
Hình 1.2. Các dạng cấu trúc mạng lưới gel hình thành của protein khi thay đổi nồng độ protein, pH và độ mạnh ion [53]
1.7.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới đặc tính gel protein sữa đậu nành [17, 53]
1. Ảnh hưởng của nồng độ protein
Nồng độ protein là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng tới loại gel và đặc tính cuối cùng của gel protein sữa đậu nành.
Gelatin có thể hình thành gel ở nồng độ tương đối thấp. Trong khi đó globulin nồng độ cao hơn nồng độ của gelatin mới tạo gel.
Để đủ điều kiện tạo gel thì hàm lượng protein trong sữa đậu nành tối thiểu là 8%. Ngoài ra nếu hàm lượng glycinin cao thì quá trình hình thành gel dễ dàng, ngược lại nếu hàm lượng glycinin thấp việc tạo gel khó khăn do chúng có xu hướng tách ra.
Độ bền cơ học của gel cũng phụ thuộc vào nồng độ protein, vì độ bền liên quan tới số liên kết ngang tạo thành trên chuỗi protein. Giữa độ bền cơ học của gel và nồng độ protein có mỗi quan hệ tuyến tính.
Nồng độ protein (Protein concentration) pH Độ mạnh ion (Ionic strength ) Cao Gần pI Cao Thấp Xa pI Thấp
2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đun nóng
Một trong những ảnh hưởng của nhiệt độ lên protein của đậu nành là làm thay đổi cấu trúc bậc 4 của nó.
Glycinin và conglycinin bị biến tính lần lượt ở nhiệt độ 85 ÷ 95oC và 65 ÷ 75oC. Điểm khác biệt giữa hai phân đoạn protein trên là trong glycinin có một lượng lớn cầu disulfit.
Nếu nhiệt độ đun nóng vượt quá nhiệt độ biến tính tối thiểu cần thiết để hình thành gel thì tính chất lưu biến của gel bị ảnh hưởng. Ngược lại nếu đun nóng protein ở nhiệt độ thấp hơn, đòi hỏi phải kéo dài thời gian cho quá trình hình thành gel hơn so với thời gian tạo gel khi đun nóng ở nhiệt độ cao. Điều này cũng dẫn tới quá trình hình thành gel yếu hơn. Nhiệt độ thấp không đủ để hình thành mạng lưới không gian ba chiều có độ chắc lớn nhất.
Khi đun nóng dịch phân tán protein ở nhiệt độ cao vượt quá nhiệt độ biến tính protein của sữa đậu nành có thể gây ra hiện tượng biến chất và không có sự hình thành gel sau này.
3. Ảnh hưởng ion mạnh
Khi bổ sung 2% muối NaCl vào dịch sữa đậu nành làm tăng tỷ lệ tạo gel của glycinin và conglycinin. Tuy nhiên khi tăng nồng độ muối NaCl lên 10% quá trình tạo gel không diễn ra. Tác dụng của việc bổ sung NaCl hàm lượng thấp lên quá trình tạo gel là để trung hoà điện tích. Ngược lại khi bổ sung muối với hàm lượng cao sẽ ngăn cản quá trình tạo gel do đã kéo theo một số thay đổi của protein sữa đậu nành cũng như làm tăng tương tác kỵ nước.
4. Ảnh hưởng của pH [46]
Quá trình biến tính protein, các tương tác giữa protein và protein hay giữa protein và dung môi bị ảnh hưởng bởi pH. Điều chỉnh pH là cần thiết để đạt được tỷ lệ cân bằng thích hợp giữa quá trình biến tính và tổ hợp lại, cũng như lực hút và lực đẩy giữa các chuỗi protein gần nhau. Khi pH > 12 quá trình tạo gel bị ức chế hoàn toàn. Điều này được giải thích rằng tại giá trị pH axit các chuỗi polypeptide tích điện tích dương. Còn ở giá trị pH kiềm cao các chuỗi polypeptide tích điện âm. Dưới những điều kiện này lực đẩy tĩnh điện có thể gây mất ổn định tương tác protein và protein trong quá trình hình thành mạng lưới gel dẫn tới độ mạnh gel giảm.
Tại pH trung tính tương tác giữa các nhóm tích điện dương bổ sung thêm một năng lượng phụ thúc đẩy quá trình hình thành gel.
Gel hình thành ở pH trung tính khả năng giữa nước giảm và độ cứng thấp hơn do thiếu lực đẩy.
1.7.3. Đặc tính protein đậu nành [14, 53]
Bằng phương pháp hoà tan dịch sữa đậu nành trong đệm có pH = 7,6 (kiềm nhẹ), 0,5 M ion mạnh, rồi siêu li tâm đã xác định được: Protein đậu nành được chia làm 4 phân đoạn với tên gọi như sau globulin 2S, 7S, 11S, 15S. Tỷ lệ các hợp chất và khối lượng phân tử các phân đoạn trên được thể hiện dưới Bảng 1.10.
Bảng 1.10. Thành phần hoá học protein của đậu nành
Trong 4 phân đoạn 2S, 7S, 11S, 15S thì 2 phân đoạn 7S và 11S là thành phần chính của protein đậu nành. Phân đoạn 7S được xem như là conglycinin của sữa đậu nành, còn 11S là glycinin.
Glycinin và conglycinin chiếm khoảng 65 ÷ 85% tổng hàm lượng protein của hạt.
1. Glycinin – globulin 11S
Cấu trúc phân tử của glycinin được mô tả như Hình 1.8. Glycinin là một oligo protein và có cấu trúc từ 6 monomer liên kết với nhau. Một cấu trúc vòng sáu của glycinin bao gồm 2 trimer, mỗi trimer gồm 3 monomer. Các monomer được sắp xếp theo một trật tự nhất định như Hình 1.8. Globulin 7S hay 11S được cấu tạo từ 12 “dưới đơn vị” tương đối ưa béo: Gồm 6 “dưới đơn vị” có tính acid (A) và 6 “dưới đơn vị” có tính bazơ (B). Các “dưới đơn vị” liên kết với nhau bằng cầu disunfit.
Phân đoạn Tỷ lệ (%) Hợp chất Khối lượng phân tử (kDa) Chất kháng trypsin 8-21 2S 22 Cytochrome c 12 Hemagglutinins 110 Lipoxygenases 102 Amylase 67,7 7S 37 Conglycinin 180 - 210 11S 31 Glycinin 350 15S 11 Polymerise glycinin 600
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử Glycinin – globulin 11S [53]
Điểm đẳng điện của các chuỗi polypeptide tạo nên từ 6 “dưới đơn vị” A là PI = 4,2 ÷ 4,8. Các chuỗi polypeptide được tạo nên 6 dưới đơn vị có tính bazơ B có điểm đẳng điện là PI = 8,0 ÷ 8,5.
2. Conglycinin – globulin 7S
Phân đoạn conglycinin được cấu tạo từ 3 “dưới đơn vị” chính có tên gọi lần lượt là α′, α, β. Cấu trúc phân tử của Phân đoạn conglycinin được cấu tạo từ 3 “dưới đơn vị” gồm α′, α, β được sắp xếp như Hình 1.9.
Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của conglycinin – globulin 7S [53]
Conglycinin là một glycoprotein với trọng lượng phân tử vào khoảng 180 ÷ 210
kDa. Các tiểu đơn vị α′, α, β có khối lượng phân tử lần lượt là 57 ÷ 72, 57 ÷ 68 và 45 ÷ 52 kDa. Các tiểu đơn vị liên kết với nhau thông qua các tương tác kỵ nước, liên kết hydro mà không có bất kỳ liên kết cầu disufit nào. Điểm đẳng điện của conglycinin là 4,64. Các
tiểu đơn vị lại có điểm đẳng điện riêng. Tiểu đơn vị gồm 4 phân đoạn từ 1-4 có PI = 5,8 ÷ 6,2. Trong khi đó các tiểu đơn vị α và α′ mỗi loại chỉ có 1 phân đoạn và có điểm đẳng điện tương ứng là 5,2 và 5,3.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. Đậu nành 2.1.1. Đậu nành
Đậu nành có tên khoa học là Glycine max Merril.
Đậu nành chọn loại có chất lượng tốt (hạt đậu tròn mẩy, đồng đều, có màu vàng sáng, hạt kém chất lượng như sâu mọt, hư hỏng ít, tỷ lệ hạt lép, hạt nứt vỡ thấp).
Đậu nành được mua tại Nha Trang.
2.1.2. Vi khuẩn lactic
Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ các sản phẩm lên men chua như nem chua, dưa chua, sữa chua, kim chi …
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Cách tiếp cận 2.2.1. Cách tiếp cận
Protein trong dịch sữa đậu nành được tủa xuống ngoài cách sử dụng Ca2+ như thường gặp, có thể sử dụng pH thấp bằng các dịch lên men [40, 41, 42, 50, 51]. Đầu tiên, ủ dịch nước ép đậu với các thực phẩm lên men lactic, đánh giá khả năng lên men để có thể chọn được chủng thích hợp với môi trường này.
Bước tiếp theo là chọn các thông số thích hợp cho quá trình lên men lactic nước ép đậu, quá trình tủa protein, … từ đó đưa ra quy trình sản xuất hiệu quả. Sản phẩm thu được sẽ có thời gian bảo quản kéo dài hơn do khi lên men, axit lactic sinh ra đã làm giảm pH dịch lên men xuống thấp, ngoài ra vi khuẩn lactic sản sinh các chất kháng khuẩn khác nhau như H2O2, bacteriocin và một số chất hữu cơ khác có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh làm tăng tính an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm so với đậu phụ sản xuất thông thường [37, 44, 50]
2.2.2. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
1. Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men
Các thực phẩm lên men được cho vào túi PE vô trùng (với tỷ lệ 25 g thực phẩm trong 225 ml nước muối sinh lý đã được tiệt trùng), đồng hoá thủ công bằng tay, sau đó cấy chuyển vào dịch ép đậu phụ, cấy chuyển nhiều lần. Ống nào có lên men lactic được sử dụng để phân lập vi khuẩn trên đĩa thạch MRS. Vi khuẩn lactic được sơ bộ định danh bằng quan sát hình thái trên tiêu bản nhuộm, và thử nghiệm catalase. Vi
khuẩn lactic có dạng hình cầu hoặc hình que, không sinh bào tử, Gram dương, catalase âm tính [7, 8, 9, 18, 34].
2. Đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn bằng phương pháp đo độ đục
Dựa trên cơ sở nếu cùng một môi trường và điều kiện nuôi cấy, chủng vi khuẩn nào phát triển mạnh, mật độ tế bào sẽ nhiều hơn, độ đục lớn hơn. Tốc độ sinh trưởng giữa các chủng được so sánh bằng phương pháp đo độ đục môi trường MRS lỏng lên men bởi các chủng lactic sau 24 giờ ở 37oC.
Độ đục được đo bằng máy đo độ đục (đục kế - turbidimeter) với các thang đo NTU theo tiêu chuẩn TCVN 6184 - 2008.
3. Khảo sát và chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic phát triển mạnh và có tính kháng khuẩn cao
Tính kháng khuẩn được kiểm tra bằng hai phương pháp là phương pháp cấy điểm và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch [28]. Các chủng chỉ thị được phòng thí nghiệm hóa - vi sinh, trung tâm thực hành, Trường Đại học Nha Trang cung cấp. Tính kháng khuẩn được biểu hiện khi kích thước bề dày vòng vô khuẩn rộng hơn 2 mm [1].
Phương pháp cấy điểm
Cả hai phương pháp cấy điểm và phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đều có cùng một mục đích chung là kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn lactic đã được lựa chọn. Tuy nhiên, phương pháp cấy điểm có thao tác dễ thực hiện và có độ nhạy cao hơn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch. Bên cạnh đó phương pháp này không phụ thuộc vào thời gian và điều kiện nuôi ủ chủng kiểm nghiệm cũng như chủng chỉ thị. Do đó phương pháp này được thực hiện trước. Nhưng phương pháp này có một hạn chế là yếu tố kháng khuẩn có thể bị bất hoạt do một số chất trong môi trường, vì vậy cần phải tiến hành thêm phương pháp đục giếng để có kết luận đảm bảo về chủng có tính kháng khuẩn.
Các chủng vi khuẩn lactic sau khi phân lập sẽ được cấy thành từng điểm trên môi trường MRS, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, 48 giờ. Các đĩa này tiếp tục được phủ một lớp thạch TSA và cấy trang các chủng chị thị lên khi bề mặt thạch TSA vừa khô, rồi đem đi ủ ở nhiệt độ 37oC, thời gian 24 giờ, tiến hành đọc kết quả.
Phương pháp “khuếch tán qua giếng thạch”
Các chủng chỉ thị được hoạt hoá từ ống giống trên thạch TSA. Sau 24 giờ, những chủng này sẽ được pha loãng trong nước muối sinh lý đã hấp vô trùng. Các đĩa
thạch TSA khô được chuẩn bị sẵn, có chiều dày 6 mm và trang các chủng chị thị lên, tiếp theo dùng ống hút nhựa đã vô trùng tiến hành đục giếng đường kính 5 mm. Dịch MRS đã cấy các dòng vi khuẩn lactic trước đó 72 giờ, nuôi ở 37oC hoặc dịch ép đậu lên men lactic 72 giờ cùng điều kiện nhiệt độ, đem đi li tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 8.000 vòng trong 15 phút, thu lấy dịch trong, dùng dịch nổi này nhỏ vào các giếng đã đục sẵn. Kỹ thuật nhỏ dịch phải đảm bảo không làm loang, dịch vừa đầy bề mặt, lượng dịch nhỏ vào là 70 μl. Cuối cùng các đĩa được ủ ở ở 37oC.
Khả năng lên men dịch ép đậu
Các chủng vi khuẩn lactic được bổ sung vào môi trường dịch ép đậu rồi lên men, sau 48 giờ tiến hành đánh giá cảm quan và đo pH.
Khả năng lên men được đánh giá bằng cảm quan [14] và đo pH bằng máy đo pH theo tiêu chuẩn TCVN 6492 : 1999.
4. Định danh chủng vi khuẩn tuyển chọn được
Chủng vi khuẩn tuyển chọn được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH.
Quá trình định danh được thực hiện bởi phòng xét nghiệm NK-BIOTEK (địa chỉ 793/58 Trần Xuân Soạn, P. Tân Hưng, Q.7, TP. HCM).
2.2.3. Bố trí thí nghiệm
1. Tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic
Hình 2.1. Thí nghiệm tuyển lựa chủng vi khuẩn lactic
Nước ép đậu phụ Thực phẩm lên men lactic Cấy chuyển nhiều lần Dịch lên men
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic phù hợp
Tiêu chuẩn để chọn vi khuẩn :
Vi khuẩn lactic
Thích hợp với môi trường chứa nước ép đậu
Có khả năng kháng khuẩn
2. Sơ đồ quy trình sản xuất đậu phụ bằng dịch ép đậu lên men lactic dự kiến
Quy trình sản xuất đậu phụ bằng nước ép đậu lên men lactic dự kiến được dựa trên quy trình sản xuất đậu phụ bằng nước chua tự nhiên [4]. Tuy nhiên trong quy trình có thay đổi một số thông số và tác nhân kết tủa đề phù hợp với điều kiện thí nghiệm và mục tiêu nghiên cứu của đề tài.
Hình 2.2. Quy trình sản xuất đậu phụ bằng dịch ép đậu lên men lactic dự kiến
Bã Lọc thô Lọc tinh Ngâm 8 giờ Nước/ đậu = 1/6 Ngâm Đậu nành Xay Ép khuôn Kết tủa Sản phẩm Nước ép đậu
lên men lactic
Đun sôi 10 phút
3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát
Xay 8 giờ Đậu nành Ngâm Xay Lọc thô Lọc tinh Dịch sữa đậu nành Đun sôi Kết tủa Chắt nước Ép khuôn Sản phẩm Đậu /nước = 1/6 Bã 10 phút Nước chắt pH = 4÷6,5 = 5÷25 phút To = 75÷95oC Tỷ lệ thạch cao = 3,4÷4,6%
Nước ép đậu lên men
lactic
Xác định hàm lượng protein
tổng số Saccharose 1-3% Protein 0,15- 0,35%