T. pseudospiralis Toàn thế giới Động vật hoang dã, chim, lợ n
1.4.2. Chẩn đoán trong thú y
1.4.2.1. Phương pháp Trichinelloscopy
Nguyên tắc của phương pháp Trichinelloscopy là sử dụng kính ép cơ, ép mẫu thịt cần kiểm tra giữa hai phiến kính, vặn vít chặt để ép mỏng cơ thịt và kiểm tra dưới kính hiển vi để phát hiện ấu trùng ký sinh trong cơ (hình 1.11).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26
Trichinelloscopy là phương pháp phát hiện Trichinella spp. truyền thống, thường được sử dụng để kiểm tra nhanh sự nhiễm ký sinh trùng Trichinella spp. tại các lò giết mổ và kiểm tra sơ bộ mẫu thịt trước khi tiến hành bằng phương pháp tiêu cơ. Ưu điểm chính của phương pháp là đơn giản, dễ thực hiện, cho kết quả nhanh, không đòi hỏi nhiều về thiết bị, hóa chất. Tuy nhiên, độ nhạy của phương pháp thấp, khoảng 43,4%, có thể không phát hiện được Trichinella spp. nếu mật độ thấp, ấu trùng chưa tạo nang kén và ấu trùng từ các loại không tạo nang kén trong cơ dẫn đến kết quả âm tính giả (Nöckler et al., 2007).
Ấu trùng trong cơ (10X20) Ấu trùng trong cơ (10X40)
Hình 1.11. Ấu trùng Trichinella spp. dùng phương pháp Trichinelloscopy
(nguồn: Nguyễn Văn Cảm, 2012)
Theo quy định của Ủy ban Châu Âu EC số 2075/2005, Trichinelloscopy
không phát hiện được Trichinella spp. không tạo nang kén lây nhiễm từđộng vật hoang dã vào vật nuôi và con người. Do đó không còn phù hợp là phương pháp tiêu chuẩn sử dụng để phát hiện Trichinella spp., đồng thời Ủy ban Châu Âu cũng khuyến cáo chỉ nên sử dụng phương pháp này trong trường hợp đặc biệt khi cần kiểm tra sự nhiễm ấu trùng Trichinella spp. tại lò giết mổđộng vật.
1.4.2.2. Phương pháp tiêu cơ
Nguyên tắc: Phương pháp tiêu cơ dựa trên việc thủy phân hoàn toàn cơ thịt của mẫu và nang của ấu trùng bằng emzym pepsin và acid hydrochloric (HCl). Sau khi cho tiêu cơ, để lắng, quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện ấu trùng Trichinella spp. (hình 1.12). Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi nhiều về thiết bị.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27 Đến nay, có 4 phương pháp tiêu cơ để xác định Trichinella spp. được ủy ban Châu Âu khuyến khích sử dụng là: Phương pháp tiêu cơ, phương pháp tiêu cơ kết hợp khuấy từ, phương pháp tiêu cơ trên bộ lọc cách ly, phương pháp tiêu cơ tựđộng. Trong bốn phương pháp trên thì phương pháp tiêu cơ kết hợp khuấy từ được chấp nhận như phương pháp tham chiếu (Nöckler et al.,
2007). Tổ chức thú y thế giới, khuyến khích sử dụng phương pháp tiêu cơ kết hợp khuấy từ đối với các phòng thí nghiệm xét nghiệm bệnh lây qua đường thực phẩm (OIE, 2012).
Hình 1.12. Ấu trùng Trichinella dùng phương pháp tiêu cơ
(nguồn: Nguyễn Văn Đề, 2012)
Phương pháp tiêu cơ kết hợp khuấy từ đã được Cơ quan thanh tra thực phẩm Canada công bố cho phép áp dụng vào năm 1996. Đến năm 1999 và 2000, Forbes L.B. và cộng sự đã hoàn thành việc xác nhận hiệu lực của phương pháp. Năm 2007, Valee và cộng sự đã phát triển phương pháp tiêu cơ thành một phương pháp hoàn chỉnh để tạo nang ấu trùng Trichinella spp., các nang này được sử dụng trong việc chuẩn bị các mẫu chuẩn. Mẫu chuẩn được sử dụng để đánh giá độ nhạy của phương pháp chẩn đoán bệnh Trichinellosis ở động vật. Việc dùng các mẫu chuẩn này trong thử nghiệm đã cải thiện đáng kể hoạt động kiểm nghiệm thực phẩm là thịt động vật tươi sống (Nöckler et al., 2007).
Về mặt lý thuyết, phương pháp tiêu cơ có khả năng phát hiện đối với những mẫu thử nghiệm ở mức độ nhiễm 1 ký sinh trùng/gam mô cơ. Nhưng độ nhạy của phương pháp thực tế khoảng 3 - 5 ký sinh trùng/gam mô cơ (Forbes and Gajadhar, 1999 ; Nöckler et al., 2007). Sự chênh lệch giữa lý thuyết và thực tế là
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28
do sự ảnh hưởng của quá trình rửa, lọc, lắng, vật liệu sử dụng, thời gian ủ (thời gian thủy phân), tình trạng của mẫu được kiểm tra, ... làm giảm hiệu quả của phương pháp tiêu cơ.
So sánh phương pháp tiêu cơ và phương pháp Trichinelloscopy cho thấy phương pháp tiêu cơ có khả năng phát hiện cao hơn 3,2 lần khi thử nghiệm trên cùng 1 gam mẫu (Forbes et al., 2003). Tuy nhiên phương pháp tiêu cơ không phát hiện được các ấu trùng non nhỏ hơn 10 - 12 ngày vì ấu trùng non sẽ bị phá hủy bởi quá trình thủy phân (Nöckler et al., 2007).
1.4.2.3. Phương pháp Elisa
Phương pháp Elisa dựa trên cơ sở sử dụng kháng nguyên xác định để phát hiện kháng thể. Các kháng nguyên được tạo ra bằng cách sử dụng kháng thểđơn dòng và các kháng thể đặc hiệu. Kỹ thuật chiết tách nhằm làm tăng độ đặc hiệu của thử nghiệm bằng cách loại bỏ các tác nhân gây phản ứng chéo với các loại ký sinh trùng khác. Kháng nguyên sử dụng trong phản ứng Elisa phát hiện kháng thể
Trichinella spp. bao gồm kháng nguyên Melcher, kháng nguyên stichosome chiết xuất sinh hóa, hoặc kháng nguyên stichosome thu được từ quá trình nuôi cấy invitro ký sinh trùng Trichinella spp..
Phương pháp Elisa được xem như một công cụ giám sát dịch tễ học, thường được sử dụng trong các chương trình giám sát và điều tra dịch tễ bệnh
Trichinellosis (OIE, 2012).
Độ nhạy và độđặc hiệu của phương pháp Elisa phụ thuộc vào loại và chất lượng kháng nguyên được sử dụng.
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng lượng kháng thể tạo ra phụ thuộc vào thời gian động vật chủ bị nhiễm Trichinella spp., kháng thể không được tạo ra trong giai đoạn đầu (3-5 tuần đầu) nhiễm Trichinella spp. Lượng kháng thể sẽ bị giảm sau vài tháng nhiễm trùng (Nöckler et al., 2000). Do đó phương pháp Elisa trong phát hiện bệnh Trichinellosisởđộng vật vẫn có tỷ lệ âm tính giả.
1.4.2.4. Một số phương pháp khác
Ngoài phương pháp Elisa phát hiện kháng thể Trichinella spp. có thể sử dụng những phương pháp khác như: Phương pháp miễn dịch huỳnh quang (IFA),
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29
phương pháp Westor blot, xét nghiệm mô miễn dịch enzyme. Nhưng các phương pháp này có nhược điểm là hóa chất và các thuốc thử không có sẵn trên thị trường. Phương pháp Westorn blot thường được sử dụng để xét nghiệm sự nhiễm chéo giữa Trichinella spp. và các loại giun khác.