T. pseudospiralis Toàn thế giới Động vật hoang dã, chim, lợ n
2.3.3. Phương pháp Elisa phát hiện kháng thể Trichinella spp.
Nguyên liệu để thực hiện phản ứng Elisa phát hiện kháng thể Trichinella
spp., khi sử dụng bộ kít PrioCHECK Trichinella Ab là huyết thanh hoặc nước thịt. Để có nước thịt, tiến hành cấp đông lạnh miếng thịt đó sau đó làm tan đông và thu hồi nước chảy ra, hoặc ép miếng thịt đó để có nước thịt.
Tiến hành:
Bước 1: Pha loãng mẫu huyết thanh bằng đĩa 96 giếng
- Nhỏ 90 µl dung dịch pha loãng mẫu vào tất cả các giếng; - Nhỏ 10µl mẫu đối chứng dương vào giếng A1 và B1; - Nhỏ 10 µl mẫu đối chứng dương yếu vào giếng C1 và D1; - Nhỏ 10 µl mẫu đối chứng âm vào giếng E1 và F1;
- Nhỏ 10 µl mẫu cần kiểm tra vào các giếng còn lại.
- Trộn đều mỗi giếng bằng pipet. Mỗi mẫu dùng 1 đầu tip riêng để tránh tạp mẫu
Trên đĩa ELISA (trong bộ kit):
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34
- Hút 20 µl mẫu đã được pha loãng ở trên (bao gồm cả các mẫu đối chứng) và nhỏ vào đĩa ELISA. Trộn đều mỗi giếng.
Bước 2: Ủ mẫu
- Ủđĩa trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng (22 ± 3 0C)
- Pha dung dịch rửa đĩa cho 1 đĩa Elisa (khoảng 300 ml): 15 ml dung dịch rửa đĩa 20X và 285 ml nước cất, trộn đều. Thêm 3 ml dung dịch bổ sung vào 300 ml dung dịch rửa đĩa đã pha
- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch rửa đã pha loãng, mỗi giếng 300 µl. Bước 3: Ủ Conjugate
- Pha Conjugate: Pha loãng 1 lượng vừa đủ conjugate cho 1 đĩa bằng dung dịch pha loãng Conjugate (400 µl conjugate và 11.6 ml dung dịch pha loãng conjugate).
Chỉ pha trước khi dùng.
- Nhỏ 100 µl conjugate đã được pha loãng vào tất cả các giếng. - Ủđĩa trong vòng 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Rửa đĩa 4 lần bằng dung dịch rửa đĩa đã pha loãng, mỗi giếng 300µl. Bước 4: Đọc phản ứng
- Nhỏ 100 µl cơ chất (TMB) vào tất cả các giếng. - Ủđĩa trong vòng 15 phút ở nhiệt độ phòng
- Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng vào tất cả các giếng.
Lưu ý: bắt đầu nhỏ dung dịch dừng phản ứng 15 phút sau khi giếng đầu tiên được nhỏ TMB.
- Lắc nhẹđĩa (5 – 10 giây).
- Đọc đĩa bằng máy đọc ELISA ở bước sóng 450nm hoặc 620nm trong vòng 15 phút.
Tính kết quả:
OD mẫu/OD dương tính chuẩn * 100 = X % dương tính (PP)
Kết quả chỉ có giá trị khi:
- Giá trị OD trung bình của mẫu dương chuẩn phải > 1.0 - Giá trị % dương tính (PP) của mẫu chuẩn yếu phải > 35%
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35
- Giá trị trung bình của mẫu đối chứng âm phải < 0.2
Giải thích kết quả:
- Mẫu dương tính nếu kết quả >= 15 PP - Mẫu âm tính nếu kết quả < 15 PP.