T. pseudospiralis Toàn thế giới Động vật hoang dã, chim, lợ n
2.3.5. Phương pháp tiêu cơ
Thực hiện theo TCVN 9851: 2013 * Chuẩn bị:
- Chuẩn bị dung dịch thủy phân: Dùng một bình thủy tinh có thể tích 4 lít, cho vào 3 lít nước, thêm vào 30ml ± 0,5 ml acid hydrochloric (HCl 37%), gia nhiệt đến 46°C - 48°C; đặt cốc lên bếp khuấy từ; thêm vào 15g ± 0,15 g pepsin (2.000 FIP-U hoặc 30g±0.3g pepsin 1.000 FIP-U)
- Chuẩn bị mẫu: 100g mẫu được xay nhỏ trong máy xay. * Thủy phân mẫu:
- Chuyển mẫu đã xay vào bình 4 lít (chứa nước, pepsin và acid hydrochloric).
- Dùng bình tia chứa dịch thủy phân rửa sạch lồng và nắp xay máy để lấy phần thịt còn bám lại.
- Phủ cốc bằng lá nhôm.
- Trong suốt quá trình thủy phân: Giữ bếp khuấy từ ở nhiệt độ 44°C đến 46°C (đặt bếp trong tủ ấm 45±10C), điều chỉnh tốc độ vòng xoáy đảm bảo dịch thủy phân phải tạo ra một xoáy sâu mà không bị bắn tung tóe.
- Giữ dịch thủy phân trên bếp từ cho đến khi các hạt thịt bị thủy phân hoàn toàn (khoảng 30 phút). Nếu cần thiết có thể kéo dài thời gian thủy phân (không
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
quá 60 phút) khi xử lý một số loại thịt (lưỡi, thịt thú rừng, …).
- Tắt bếp, dịch thủy phân được đổ qua lưới lọc (lưới lọc có kích thươc 180µm) vào bình lóng thứ nhất (bình lóng 4 lít).
Quá trình thủy phân đạt yêu cầu nếu trên 95% cơ thịt bị thủy phân. * Lắng mẫu:
- Dịch thủy phân được để yên trong bình thủy tinh thứ nhất trong 30 phút. - Sau 30 phút, lấy nhanh 125 ml mẫu từ dịch thủy phân từ bình thủy tinh thứ nhất vào bình lóng thứ hai (bình lóng 500ml).
- Để yên dịch thủy phân trong bình thủy tinh thứ hai trong ít nhất 10 phút. - Từ bình thủy tinh thứ hai lấy 22-27ml dịch thủy phân ra đĩa đếm ấu trùng hoặc đĩa petri (đường kính 90mm)
- Để yên dịch thủy phân trong 10 phút. - Kiểm tra mẫu dưới kính hiển vi soi nổi.
Lưu ý: Dịch thủy phân và chất thải lỏng khác được giữ trong bình thủy tinh cho đến khi hoàn tất việc đọc kết quả.
- Kiểm tra mẫu: mẫu được kiểm tra bằng kính hiển vi soi nổi ở một độ phóng đại 15-20 lần. Trong trường hợp các vùng nghi ngờ có hình dạng giống như ký sinh trùng, cần sử dụng độ phóng đại cao hơn 60-100 lần.
Dịch thủy phân phải được kiểm tra ngay sau khi chuẩn bị hoàn tất. Trong mọi trường hợp việc kiểm tra không được hoãn lại đến ngày hôm sau.
Nếu dịch thủy phân không được kiểm tra trong vòng 30 phút sau khi chuẩn bị, chúng phải được giữ như sau:
+ Khoảng 40ml mẫu cuối cùng được đổ vào một ống đong/ ống falcon, để yên trong 10 phút.
+ 30 ml dich nổi trên mặt được hút bỏ, để lại lượng lắng 10 ml. + Tiếp tục thêm vào 30ml nước.
+ Để thêm 10 phút hút bỏ 30 ml dịch nổi trên mặt, để lại lượng lắng không quá 10 ml để kiểm tra trên đĩa petri; bình đong được rửa sạch bằng 10ml nước và được thêm vào trong đĩa petri.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37
Nếu lớp lắng được kiểm tra mà không cho kết quả rõ ràng, mẫu được đổ vào một ống đong và thêm nước máy đểđược 40ml và sau đó tiếp tục quy trình trên. Quy trình này có thểđược lặp đi lặp lại 2-4 lần cho đến khi dịch đọc cho kết quả rõ ràng đáng tin cậy.
* Đọc kết quả
Xác định ấu trùng Trichinella spp. dưới kính hiển vi soi nổi: ấu trùng giai đoạn đầu tiên, sau khi thủy phân các tế bào cơ, có kích thước khoảng 1mm ×0,03 mm. Ấu trùng Trichinella có thể xuất hiện ở dạng cuộn (khi lạnh), di động nhiều hơn (khi nóng) hoặc hình chữ C (khi chết). Trong trường hợp nghi ngờ, ấu trùng phải được xem ở độ phóng đại cao hơn và kiểm tra các tế bào cơ. Nếu số lượng ấu trùng quá cao thì cần pha loãng dung dịch tới nồng độ thích hợp trước khi kiểm tra.