X: M tđ quang (OD) ca enzyme chitinases hayβ-1,3-glucanase
3.3.4 Shin din ca các gene đ iu khin st ng hp chitinase các ch ng Trichoderma tri n v ng
Các ch ng Trichoderma có hi u qu t t trong các thí nghi m sinh tr c đã đ c ch n đ xác đ nh các gene mã hóa giúp t ng h p chitinase nh m ph c v cho các nghiên c u sau này.
K t qu (Hình 3.32) cho th y qua ki m đ nh PCR v i c p m i 1 (nag, v i s n ph m PCR t c p m i có kích th c 830 bp), c 8 ch ng Trichodermađ u có s hi n di n c a gene mã hóa chit73 giúp t ng h p enzyme CHIT73 (chitobiase). Khi đ c đi n di trên agarose gel, gene này n m v trí 800-900 bp c a thang chu n (ladder). Chitobiase (β-N-acetyl hexosaminidase, EC 3.2.1.52) là m t loai exo-chitinase (tr ng l ng phân t 73 kDalton) có kh n ng phân c t các dimer (diacetylchitobiose) và oligomer c a chitin (chitotriose và chitotetraose) thành các đ n phân là D-acetylglucosamin (GlcNAc) [123], giúp cây tr ng h p th và t o ch t kích thích tính kháng b nh h i cây [87], [125].
Khi ki m đ nh qua PCR v i c p m i 2 (ech42, v i s n ph m PCR t c p
m i có kích th c 900 bp), ngo i tr ch ng T-BM2a, c 7 ch ng
Trichoderma đ u có hi n di n gene mã hóa ech42 giúp t ng h p enzyme ECH42 (là m t endo-chitinase). S hi n di n c a gene này đã giúp các ch ng
So v i k t qu đo O.D (m t đ quang) trên 5 ch ng Trichoderma có tri n v ng n i dung 3.3.1, k t qu ki m đ nh này đã cho th y ngo i tr T- BM2a, c 4 ch ng T-LV1a, T-OM2a, T-TO2a, T-TO2b có kh n ng ti t endo- và exo-chitinase cao đ u có s hi n di n c a 2 gene mã hóa chit73 và
ech42. i v i T-BM2a, giá tr c a exo-chitinase (OD) c ng nh s hi n di n c a gene mã hóa chit73, còn endo-chitinase (O.D) c a T-BM2a (n i dung 3.3.1) có th do gene khác đi u khi n nên đã không bi u hi n qua k t qu PCR v i c p primer ech42.
Nh v y, dù hi n di n v i l ng OD khác nhau, c 5 ch ng trên đ u s n sinh exo-chitinase d ng chitobiase qua s đi u khi n c a gene chit73, enzyme này có tr ng l ng phân t 73 KDalton. Chitobiase là enzyme giúp phân c t các diacetylchitobiose (là dimer c a glucosamin) t chitin thành glucosamin (monomer) nên đã góp ph n phân c t chitin trong vách t bào c a n m b nh thành glucosamin, giúp cây t ng c ng kh n ng kích kháng v i n m b nh nh k t qu nghiên c u c a n i dung 3.3.3.
1.000 bp
500 bp
Hình 3.32 K t qu PCR (đi n di trên agarose gel 1,5%) nh n d ng gen chitinase B ng (1): ladder - C p primer 1 (chit-73): b ng 2-9: (2) T-LV1a, (3) T-OM2a, (4) T-TO2a, (5) T-TO2b, (6) T-9, (7) T-CTTG6b, (8) T-LM3c, (9) T-BM2a
- C p primer 2 (ech-42): b ng 10-17: (10) T-LV1a, (11) T-OM2a, (12) T-TO2a, (13) T-TO2b, (14) T-9, (15) T-CTTG6b, (16) T-LM3c, (17) T-BM2a
500 bp 300 bp 300 bp
¬ Xác đnh loài c a các ch ng Trichoderma tri n v ng
K t qu ki m tra qua đi n di (Hình 3.33) cho th y s n ph m PCR t các ch ng Trichoderma phân l p đ c đ u có kích th c n m trong kho ng cho phép. Các s n ph m PCR t c p m i ITS có kích th c 500 – 600 bp, t c p m i
tef có kích th c 200 – 300 bp và t c p m i EF có kích th c 300 – 400 bp.
C p m i ITS C p m i tef
Ký hi u: 1: Marker 100 bp, 2: T-BM2a, 3: T-LV1a, 4: T-OM2a, 5: T-TO2a, 6: T-TO2b, 7: T-9, 8: T-CTTG6b, 9: T-LM3c, 10: T- VTu3g, 11: T-OM9e.
C p m i EF
Hình 3.33 Ki m tra s n ph m PCR qua k t qu đi n di trên gel agaroe (1,5%)
N m ch ng Trichoderma tri n v ng (T-BM2a, T-LV1a, T-OM2a, T-TO2a, T-TO2b) đã đ c xác đ nh loài b ng ph ng pháp gi i trình t DNA (DNA sequencing) cùng 5 ch ng khác. K t qu gi i trình t đo n DNA c a vùng ITS, TEF và EF đ c so v i các mã s đ ng ký c a ngân hàng gene qu c t NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi) đ xét đ t ng đ ng c a các vùng m c 99 - 100%.
B ng 3.16 cho th y 5 ch ng Trichoderma tri n v ng đ c xác đ nh thu c 2 loài: Trichoderma harzianum Rifai (giai đo n h u tính là Hypocrea lixii, ch ng T-BM2a, T-TO2a và T-TO2b) và T. asperellum (T-LV1a và T-OM2a). Ngoài ra còn có các loài T.virens và T. viride trên 4 ch ng b n đ a còn l i.
500 bp
1.000 bp
500 bp 200 bp 200 bp
B ng 3.16 K t qu xác đ nh loài Trichoderma d a vào d li u c a NCBI
Ch ng C p m i ITS tef EF
STT
Mã s đ ng ký c a NCBI Tên loài