- Mô hình vn đánh giá kh nng đi kháng c a các ch ng Trichoderma tri n v ng đ
Ni dun g
2.3.4 Xác đ nh shin din ca các gene đ iu khin st ng hp chitinase các ch ng Trichoderma tri n v ng
Các ch ng Trichoderma có hi u qu t t trong các thí nghi m sinh tr c
đ c ch n đ xác đ nh các gene mã hóa chitinase nh m ph c v cho các nghiên c u sau này. Thí nghi m th c hi n v i 8 ch ng Trichoderma g m:
1- T-BM2a 5- T-TO2b
2- T-LV1a 6- T-9
3- T-OM2a 7- T-CTTG6b
4- T-TO2a 8- T-LM3c
Các s n ph m DNA c a các ch ng Trichoderma sau khi đ c ly trích xong đ c ki m tra các gene t ng h p các chitinase thông qua các c p primer chuyên bi t. Quy trình ly trích DNA đ c trình bày qua ph ch ng 4.
Hai c p m i (primer) đ c s d ng trong thí nghi m là:
- C p 1: Gene mã hóa chit73 v i s n ph m PCR t c p m i có kích th c 830 bp, giúp t ng h p exo-chitinase (chitobiase, 73 KDalton) [100]:
nagF: 5’-GCTGATATGGCCGCTCGAGTACCTAGATC-3’ nagR: 5’-CCTTGGGCAGCATCTAGAACGACCGAGG-3’
Ch ng trình PCR v i kh i đ u 95oC (1') và th c hi n 30 chu k g m: Phát tri n: 95oC (1'), 59oC (1'), 74oC (1' 30") + chuy n 74oC (7').
- C p 2: Gene mã hóa ech42 v i s n ph m PCR t c p m i có kích th c 900 bp, giúp t ng h p endo-chitinase (42 KDalton) [26]:
F: 5’-CTTGTAGTCCCAAATACCGTTCTCCCA-3’ R: 5’-GCAAACGCCGTCTACTTCACCAACTGG-3’ R: 5’-GCAAACGCCGTCTACTTCACCAACTGG-3’ Ch ng trình PCR th c hi n v i 30 chu k g m: Phát tri n 95oC (1'), 50oC (2'), 72oC (2') + chuy n 72oC (7'). B ng 2.1 Các thành ph n tham gia PCR Thành ph n Th tích (μl) - N c c t 2 l n 40,25 - Buffer # 9 (10 X) (*) 5,00 - dNTPs (10 mM) 1,50 - Primer F (100 pmol/μl) 0,50 - Primer R (100 pmol/μl) 0,50 - DNA (25 ng/μl) 2,00 - Taq polymerase 0,25 T ng 50,00 Ghi chú:(*) Buffer # 9(10 X): 0,1 M Tris-HCl + 15 mM MgCl2 + 0,25 M KCl pH 9,2
S n ph m PCR đ c ki m tra b ng cách ch y đi n di v i agarose gel 1,5% trong dung d ch TE 1X (50 volt, 30 phút), sau đó ch p hình trên máy đ c gel.
¬ Xác đ nh loài c a các ch ng Trichoderma tri n v ng
Song song v i vi c xác đ nh m t s gene quy đ nh t ng h p chitinase
Vi c xác đ nh trình t các nucleotid đ c th c hi n b ng các b c sau: Nhân dòng DNA (PCR) và gi i trình t các đo n gene b ng máy ABI 3130. Ba c p m i chuyên dùng đ c dùng đ nhân dòng gene và xác đ nh trình t gene
đ c trình bày qua B ng 2.2.
Ch ng trình PCR đ c th c hi n v i 35 chu k g m: Phát tri n: 95oC (15''), 59oC (60''), 72oC (120") + chuy n 72oC (10'). Gi ph n ng 4oC.
B ng 2.2 Các c p m i tham gia PCR
Primer Trình t Trích d n
ITS1 (forward) 5’-TCGGTAGGTGAACCTGCGG-3’ >500 bp
ITS4 (reverse) 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
tef1fw 5’-GTGAGCGTGGTATCACCATCG-3’ 200 bp tef1rev 5’-GCCATCCTTGGAGACCAGC-3’ [154] EF1-728F 5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’ 300 bp EF1-986R 5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’ [160]
S n ph m PCR đ c ki m tra b ng cách ch y đi n di v i agarose gel 1,5% trong dung d ch TE 1X (50 volt, 30 phút).
N i dung 4
2.4 Tác đ ng c a các dinh d ng khoáng N, P, K, Ca, Mg và sa c u đ t đ n m i quan h gi a Trichoderma và F.solani đ n m i quan h gi a Trichoderma và F.solani
2.4.1 Nghiên c u in-vitro tác đ ng c a các dinh d ng khoáng N, P, K, Ca và Mg lên s phát tri n và hình thành bào t c a Trichoderma