- Mô hình vn đánh giá kh nng đi kháng c a các ch ng Trichoderma tri n v ng đ
Ni dun g
2.3.2.1 Sinh trc ngh im kh nng cch bà ot F.solani ca các ch ng
Trichoderma có tri n v ng
T k t qu tr c nghi m kh n ng ti t các chitinase đ i kháng (n i dung 2.3.1), các ch ng Trichoderma có kh n ng đ i kháng cao đã đ c ch n kh o sát nh m đánh giá hi u qu c a chitinase trong vi c c ch s m c m m c a
đ i bào t F. solani t d ch trích c a Trichoderma đã nuôi c y trong môi tr ng l ng TSM. Thí nghi m đ c ti n hành qua 2 giai đo n:
¬Giai đo n 1: ánh giá kh n ng c ch bào t Fusarium c a ch ng
Trichoderma T-TO2b trong môi tr ng nuôi c y TSM có (ho c không) b sung thêm chitin và s i n m Fusarium. Thí nghi m nh m ch n môi tr ng phù h p giúp Trichoderma ti t chitinase hi u qu đ c ch bào t F. solani
Thí nghi m th c hi n trên bình tam giác (250 ml) ch a 100 ml môi tr ng, nuôi l c (120 vòng/phút) trong 7 ngày (nhi t đ phòng 27 - 32°C). Ch ng
Trichoderma T-TO2b (s n sinh nhi u chitinase) đ c nuôi c y (m t s 1,7 x 106 bào t /ml) trong môi tr ng TSM có thêm chitin (0,5%, Sigma Co.), ho c không chitin, ph i h p cùng ch ng F. solani F-OM2. Do phát tri n ch m, F-OM2
đ c nuôi c y tr c 2 ngày (m t s 1,4 x 105 bào t /ml) đ k p phát tri n khu n ty, t o đi u ki n đ Trichoderma (phát tri n nhanh h n) có kh n ng đ i kháng.
Sáu nghi m th c v môi tr ng nuôi c y đ c b trí theo th th c hoàn toàn ng u nhiên, 2 nhân t (factorial experiment in completely randomized design), 3 l p l i. Các nghi m th c g m: i ch ng (môi tr ng có/không chitin), môi tr ng nuôi c y có Trichoderma T-TO2b (có/không chitin) và môi tr ng nuôi c y có Trichoderma T-TO2b + F.solani F-OM2 (có/không chitin).
Quy trình trích c i ti n t quy trình c a phòng thí nghi m B nh Cây và B o V Th c v t (đ i h c Leuven). D ch trích môi tr ng đ c l c, hút áp su t qua gi y l c (Whatman # 5, 2 l p) đ lo i bào t và khu n ty, sau đó tr
1oC. L y 5 ml d ch trích + 0,5 ml glucose (20 g/l) và Tween 20 (10 µl/l) + 50 đ i bào t F. solani (đã nuôi c y t 2 tu n tr c trên PDA, đ m qua lam
đ m Malassez, pha loãng đ n 50 bào t /10 l). Quan sát qua kính hi n vi và
đ m t l (%) m c m m c a bào t Fusarium sau 4, 8, 24, 48 và 72 gi nuôi trong h n h p d ch trích. S li u đ c hoán chuy n sang X+0,01 ( 4; 8 gi ),
arcsin X/100 ( 24; 48; 72 gi ), phân tích th ng kê theo ph n m m IRRISTAT, so sánh s khác bi t đ ý ngh a 5% qua phép th Duncan.
¬Giai đo n 2: T k t qu c a giai đo n 1, môi tr ng có hi u qu c ch bào t Fusarium thích h p nh t (TSM + chitin + khu n ty F-OM2) đã đ c ch n
đ đánh giá kh n ng c ch m c m m bào t Fusarium c a 5 ch ng
Trichoderma b n đ a có tri n v ng (đã đánh giá kh n ng ti t chitinase qua n i dung 2.3.1), g m T-BM2a, T-LV1a, T-OM2a, T-TO2a và T-TO2b, v i ch ng s n sinh nhi u chitinase làm đ i ch ng (+) là T-9 (T. atroviride, do đ i h c Công Ngh Vienna, Áo cung c p). i ch ng âm (-) là môi tr ng TSM-C không có ch ng n m. Quan sát trên kính hi n vi và đ m t l m c m m c a 50 đ i bào t
72%). S li u th ng kê đ c hoán chuy n v phân b chu n b ng X+0,01 ( 4 gi ), arcsin X/100 ( 24; 48 và 72 gi ), phân tích th ng kê theo ph n m m IRRISTAT, th th c hoàn toàn ng u nhiên, 4 l p l i. So sánh khác bi t đ ý ngh a 5% theo phép th Duncan.
2.3.2.2 nh h ng c a pH môi tr ng nuôi c y đ n kh n ng c ch m c
m m bào t F. solani c a các ch ng Trichoderma
T k t qu thí nghi m c a n i dung 2.3.2.1, thí nghi m kh o sát kh n ng c ch bào t Fusarium c a các ch ng Trichoderma khi pH môi tr ng thay đ i
đã đ c th c hi n ti p theo. Sáu ch ng Trichoderma T-BM2a, T-OM2a, T- LV1a, T-TO2a, T-TO2b và T-9 (nh p n i, s n sinh nhi u endo-chitinase, đ i ch ng +) và ch ng F.solani F-OM2 đ c nuôi c y trong bình tam giác (v = 250 ml) 3 m c đ pH khác nhau (4,2; 5,5; 7,0) trong môi tr ng TSM-C (TSM broth + 0,5% chitin). t o tr c sinh kh i nh m kích thích Trichoderma ti t chitinase, ch ng Fusarium F-OM2 đ c nuôi c y (m t s 105 bào t /ml) tr c
Trichoderma (106/ml bào t ) 2 ngày, l c 120 vòng/phút (rpm) trong 7 ngày ( nhi t đ phòng 25 - 34oC). Sau nuôi c y, d ch trích môi tr ng đ c l c qua gi y l c (Whatman # 5) và đánh giá s hi n di n c a chitinase trong d ch trích qua cách th kh n ng m c m m c a đ i bào t F. solani nh n i dung 2.3.2.1.
Thí nghi m đ c b trí theo th th c hoàn toàn ng u nhiên, 4 l p l i v i 2 nhân t : (a) Các ch ng Trichoderma và (b) 3 m c đ pH (4,2; 5,5 và 7,0). S li u đ c phân tích th ng kê theo ph n m m IRRISTAT và so sánh s khác bi t theo phép th Duncan đ ý ngh a 5%.
2.3.2.3 ng d ng ph ng pháp sinh tr c nghi m đ đánh giá kh n ng c ch m c m m bào t F. solani c a các ch ng Trichoderma s u t p