- Mô hình vn đánh giá kh nng đi kháng c a các ch ng Trichoderma tri n v ng đ
2.3Kho sát mit ng tác gia Trichoderma và F.solani trên khí ac nh hoá sinh và DNA
Ni dun g
2.3Kho sát mit ng tác gia Trichoderma và F.solani trên khí ac nh hoá sinh và DNA
hoá sinh và DNA
2.3.1 Tr c nghi m kh n ng ti t chitinase đ i kháng c a các ch ng
Trichoderma
Các ch ng Trichoderma, g m 17 ch ng phân l p t đ t v n tr ng cam quít c a BSCL (ph ch ng 3) và ch ng T-382 (c a đ i h c Ohio, M ) làm
đ i ch ng (+) đ c nuôi c y và phân tích các chitinase do chúng ti t ra. Thí nghi m đ c th c hi n t i phòng thí nghi m B nh Cây và B o V Th c v t (Laboratory of Phytopathology and Plant Protection), tr ng đ i h c K.U. Leuven (V ng qu c B ). Thí nghi m đ c b trí hoàn toàn ng u nhiên, 4 l n l p l i. Quy trình trích endo- và exo-chitinase đ c th c hi n theo chu n c a phòng thí nghi m này và ti n hành nh sau:
Các ch ng n m (c y 2 x 106 bào t /ml) đ c nuôi trong bình tam giác (250 ml) ch a 125 ml môi tr ng đ c bi t có chitin g m collagen (0,1%), chitin (0,5%, Sigma Co.), NAG (N-Acetyl-Glucosamin 0,2%, Sigma Co.) và bactopeptone (0,1%, Difco Co.). Sau 5 ngày nuôi l c ( 26°C, 116 vòng/phút), d ch trích đ c l c qua gi y l c (Whatman # 5), sau đó đông khô l nh (qua lyophilisor, hi u Leybold-Heraeus, model GT2) trong 8 gi . S n ph m đ c hòa v i 5 ml n c c t và l c qua đêm ( 40C) b ng màng bán th m # 3 (dialysis membrane, size 3, Medicel Int. Co., kh n ng l c 12-14 KDa) đ lo i các h p ch t có phân t kh i < 12 KDa. D ch trích ch a các chitinase đ c thêm dung d ch đ m pH 4 (NaOAcetate 0,1M) đ đo exo-chitinase và pH 9
(Tris 0,1M) đ đo endo-chitinase. Dung d ch đo g m: 5 µl d ch trích chitinase, 695 µl dung d ch đ m (pH 4/pH 9) và 100 µl CM-Chitine-RBV 2‰ (Loewe Biochemica GmbH Co.). H p ch t đ c 37°C (1 gi ) đ ho t hóa enzym, sau đó ng ng ph n ng b ng HCl 4N (200 µl), làm l nh (10') và cu i cùng ly tâm (13.000 vòng/phút) đ lo i k t t a. Các m u đo đ c l p l i 3 l n. K t qu đ c đo qua quang ph k (spectrophotometer, hi u Beckman, model DU-530) b c sóng 520 nm và tính m t đ quang (O.D: optical density) so v i đ i ch ng không ch a enzyme (O.D = 0).
2.3.2 Kh o sát kh n ng c ch s m c m m c a đ i bào t F. solani t các ch ng Trichoderma (k thu t sinh tr c nghi m)