trưởng của cây mầm lúa trong điều kiện ngập úng in vitro
Để theo dõi sự kháng chéo của cây mầm lúa trong điều kiện ngập úng, yếu tố nhiệt độ 450
C và thời gian xử lý nhiệt độ 450
C được khảo sát.
Hạt lúa được cấy vào môi trường MS 1/2, sau 24 giờ được bổ sung 15 mm nước. Sau đó, các hạt lúa được xử lý 450
C bằng cách đặt các ống nghiệm trong tủ nhiệt với thời gian khác nhau là 0 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút. Ống nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt lúa, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại.
Theo dõi cây mầm ở các điều kiện xử lý qua các chỉ tiêu: chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ. Đối chứng với cây mầm trong môi trường MS 1/2 ngập 15 mm không kèm nhiệt độ (0 phút) và ghi nhận kết quả sau 6 ngày nuôi cấy.
Thời gian thích hợp để xử lý 450C sẽ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.9. Xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô
Cây mầm lúa qua 4, 6, 8 ngày được nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 có hoặc không gây ngập úng, hoặc ngập úng kèm xử lý 450
C (15 mm - 450C) được xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô để khảo sát sự tăng
trưởng. Mẫu được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch, thấm khô và cân để xác định trọng lượng tươi. Sấy mẫu trong 6 giờ ở 800C để loại nhanh hoạt động của enzym sau đó sấy mẫu liên tục ở 600C cho đến khi trọng lượng không đổi và cân để xác định trọng lượng khô (Bùi Trang Việt 1992). Ghi nhận kết quả sau 3 lần cân ở mỗi mẫu.
2.2.10. Đo hàm lượng đường và hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa
Hàm lượng đường và hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa ở 0, 4, 8 ngày sau khi nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 có hoặc không gây ngập úng hoặc ngập úng kèm xử lý 450C được ly trích và đo để khảo sát khả năng thích nghi của cây mầm trong điều kiện stress.
Xây dựng đường chuẩn
Dung dịch sucaroz và glucozo được pha chế theo các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/l. Nhuộm dung dịch đường bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ dung dịch đường : phenol : H2SO4 đậm đặc là 1 : 1 : 5 theo thể tích.
Sau khi nhuộm màu dung dịch đường, lắc đều, để yên 15 phút, tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm. Thu các giá trị đo được và vẽ đường chuẩn của sucaroz và glucozo theo 10 nồng độ khác nhau.
Đo hàm lượng đường trong cây mầm lúa
Cân 1 g trọng lượng tươi cây mầm rồi nghiền với 10 ml cồn 960, đun sôi cách thủy lọc lấy phần dịch. Phần bã ly trích với cồn 800 (lặp lại hai lần). Phần dịch được làm bay hơi bằng cách đun cách thủy cho cô cạn dung dịch, rồi pha loãng với nước theo một thể tích nhất định, ta thu được dịch trích đường.
Dịch trích đường được cho phản ứng với phenol 5% và H2SO4 đậm đặc (theo tỉ lệ 1 : 1 : 5).
Hàm lượng đường được tính bằng cách so sánh với đồ thị đường cong chuẩn sucaroz.
Đo hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa
Cân 1g trọng lượng tươi cây mầm rồi nghiền với 10 ml cồn 960, đun sôi cách thủy lọc lấy phần dịch. Phần bã ly trích với cồn 800 (lặp lại hai lần). Phần bã có chứa tinh bột được sấy ở nhiệt độ 600C. Đun cách thủy phần bã với 5 ml nước cất trong 15 phút, để nguội. Thêm 2 ml HClO4 9,2 N, khuấy đều trong 15 phút. Thêm nước cất vào cho đủ 10 ml và ly tâm 4000 vòng trong 30 phút. Thu được dịch lỏng 1.
Phần bã tiếp tục ly trích với 2 ml HClO4 4,6 N, khuấy đều trong 15 phút. Pha loãng thành 10 ml rồi ly tâm như trên. Thu được dịch lỏng 2, gộp chung dịch lỏng 1 và 2. Đem dung dịch tinh bột thu được pha loãng với nước theo một thể tích nhất định.
Dung dịch tinh bột được cho phản ứng với phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc (theo tỉ lệ dung dịch đường : phenol : H2SO4 đậm đặc là 1 : 1 : 5).
Đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm. Tính hàm lượng đường glucozo theo đường chuẩn glucozo.
Hàm lượng tinh bột được tính theo công thức:
a : lượng đường glucozo sau khi phân giải b : độ pha loãng
0,9 : hệ số chuyển đổi
n : trọng lượng mẫu được phân tích
2.2.11. Đo cường độ hô hấp (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cây mầm lúa 0, 4, 8 ngày sau khi nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 (đối chứng), MS 1/2 có ngập úng 15 mm hoặc ngập úng 15 mm kèm xử lý 450
C (15mm - 450C), được đo cường độ hô hấp bằng máy Warburg. Điều kiện đo:
nhiệt độ 25 ± 10C, trong tối.
- Cân 1 g trọng lượng tươi cây mầm, đựng trong nước cất.
- Cho vào thân bình Warburg 2 ml nước cất. Cho vào trụ giữa 0,5 ml dung dịch KOH 20%. Dùng kẹp cho mảnh giấy lọc đã được gấp nếp vào trụ giữa, sau đó cho các cây mầm vào thân bình (1 g cây mầm/bình). Thực hiện một bình nhiệt – khí – áp kế với 2,5 ml nước cất (không có mẫu vật).
Thoa vaselin vào mặt trong cổ bình, ống nhánh, đậy kín nút ống nhánh. Gắn bình Warburg vào áp kế. Gắn áp kế này vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước. Mở khóa chia ba để áp kế thông với khí quyển.
- Cho lắc 10 phút. Điều chỉnh mực chất lỏng trong áp kế đến vạch 150. - Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp kế hoàn toàn kín. Mở máy lắc, ghi thời điểm bắt đầu đo. Sau 15 phút ngừng máy lắc, điều chỉnh mực chất lỏng trong nhánh kín của áp kế về vạch 150. Đọc trị số ∆P bằng số mm chất lỏng Brodie chênh lệch giữa hai nhánh áp kế. Tính trị số ∆V ở bình qua hệ thức ∆V = K. ∆P. Từ đó, tính cường độ hô hấp của khúc cắt (µO2/g trọng lượng tươi/giờ).
Cường độ hô hấp của các cây mầm là giá trị của 3 lần lặp lại cho mỗi thời điểm tăng trưởng của cây mầm.
(Nguyễn Du Sanh và cs, 2011)
2.2.12. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong cây mầm lúa
Cây mầm lúa sau 0, 4, 8 được nuôi cấy trong môi trường MS 1/2 (đối chứng), MS 1/2 có ngập úng 15 mm hoặc ngập úng 15 mm kèm xử lý 450
C, được ly trích và đo các chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Ly trích và phân lập
Để ly trích và phân lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, người ta thay đổi pH của dịch hòa tan và dùng các dung môi thích hợp (ete, butanol
bão hòa nước), trước khi áp dụng phương pháp sắc ký.
Nghiền 1 g cây mầm, thêm 20 ml metanol 80%, để trong tối ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp thu lấy dịch lọc. Lọc thêm 2 lần nữa với 20 ml metanol 80% mỗi lần. Cô cạn dịch lọc dưới quạt. Thêm 5 ml nước cất vào phần dịch cô cạn, chỉnh pH 2,5 bằng dung dịch HCl 1%. Dịch lọc được chuẩn trên giấy sắc kí. Sơ đồ ly trích và phân đoạn như ảnh 2.1.
Sắc ký
Đặt bản silicagel 60 F254 (20 x 20 cm) (Merck) đã được chấm sắc ký vào thùng sắc ký chứa dung môi di chuyển chloroform : metanol : acid acetic (80 : 15 : 5 theo thể tích). Khi mức dung môi di chuyển còn cách mép trên của bản sắc ký khoảng 1 cm, quá trình chạy sắc ký kết thúc. Đèn UV 254 nm và 320 nm được sử dụng để xác định vị trí chất điều hòa tăng trưởng thực vật chuẩn. Từ đó xác định vị trí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã được ly trích.
Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng cách sinh trắc nghiệm
Sau sắc ký, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được xác định tương ứng với mỗi băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn. Các ô tương ứng với từng mẫu trên mỗi băng được cắt riêng, cạo, ngâm với nước cất sau 24 giờ, được dùng trong sinh trắc nghiệm. Dung dịch chứa mỗi loại hormon thực vật/mẫu được chia làm ba phần. Mỗi phần là một lần lặp lại trên một erlen hoặc đĩa petri.
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abcisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Hạt lúa được ngâm trong nước ấm 24 giờ và gieo trên gòn ẩm, trong tối. Sau 96 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cô lập được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu được cho vào mỗi đĩa petri chứa 5 ml dung dịch ly trích
ở điều kiện tối, nhiệt độ 280C. Sau 24 giờ, hoạt tính tương đương của auxin và acid abcisic được xác định dựa vào sự sai biệt của chỉ số tăng trưởng chiều dài của diệp tiêu giữa các dịch trích, nước cất, dung dịch AIA 1 mg/l và ABA 1 mg/l.
Sinh trắc nghiệm cytokinin
Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.). Hạt dưa leo được ngâm trong nước ấm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2 mm thì tử diệp được cắt ra để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 5 tử diệp dưa leo, đặt mặt úp xuống lam kính đã được bao bằng giấy lọc thấm 10 ml dung dịch ly trích /đĩa petri. Các đĩa này được đậy lại và được đặt dưới ánh sáng 24/24 giờ với cường độ 3000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%. Sau 48 giờ, hoạt tính tương đương của cytokinin được xác định dựa vào sự sai biệt trọng lượng tươi của tử diệp dưa chuột giữa các mẫu dịch trích, nước cất và dung dịch zeatin 1 mg/l.
Sinh trắc nghiệm giberelin
Hoạt tính giberelin được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Hạt xá lách được ngâm trong nước ấm 2 giờ và cho nảy mầm ở 2000 ± 200 lux, nhiệt độ 30 ± 10C, ẩm độ 65 ± 5%. Sau 24 giờ các hột với rễ mầm nhú ra 1 mm, đặt 10 hạt xà lách này vào mỗi erlen chứa 5 ml dung dịch ly trích chứa trong hai mảnh giấy lọc. Các erlen được đặt dưới ánh sáng 24/24 giờ với cường độ 3000 ± 200 lux, nhiệt độ 28 ± 20C. Sau 72 giờ, hoạt tính tương đương của giberelin được xác định dựa vào sự sai biệt về chiều cao của trụ hạ diệp xà lách giữa các mẫu dịch trích, nước cất và với dung dịch GA3 10 mg/l.
Sự ly trích, phân đoạn và sinh trắc nghiệm các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được thực hiện trong ba lần riêng biệt và tính giá trị trung bình.
Hình 2.1: Sơ đồ ly trích và cô lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (theo Bùi Trang Việt, 1992, Nguyễn Du Sanh và cs, 2011)
2.2.13. Khắc phục stress ngập úng cho cây mầm lúa ngoài tự nhiên (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cấy hạt lúa trong chậu đất có độ ẩm khoảng 80 ± 0,6%, tỉ lệ đất như sau : 1kg đất + 1kg mùn + 0,5 kg xơ dừa + 0,3 kg phân bò. Sau 1 ngày, gây ngập úng cây mầm lúa với mực nước cao 15 mm (bằng cách đổ nước vào chậu cho đến khi đất bão hòa nước và ngập sâu 15 mm). Giữ mực nước ổn định trong suốt thời gian thí nghiệm. Sau 7 ngày, trong điều kiện ngập úng, cây mầm được phun BA 10mg/l hoặc nước dừa 10% ướt đều trên lá vào khoảng 4 - 5 giờ chiều.
Thí nghiệm được bố trí với mỗi chậu 3 cây với 3 lần lặp lại. Chiều cao phần khí sinh và chiều dài rễ được ghi nhận sau 15 ngày. So sánh với cây
mầm tăng trưởng trong điều kiện không ngập úng, không xử lý với BA hay nước dừa (đối chứng).
2.2.14. Xử lí thống kê
Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Statistical Program Scientific System (SPSS) phiên bản 11.5 cho windows.
Đề tài được thực hiện từ tháng 03/2012 đến tháng 03/2013, tại phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật trường Đại học Sư phạm Hồ Chí Minh, phòng thí nghiệm Sinh lý Thực vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, vườn sinh học trường Đại học Sư phạm Hồ Chí Minh.
Chương3
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. Kết quả
3.1.1. Khảo sát môi trường in vitro thích hợp để nuôi cấy lúa
Kết quả nuôi cấy hạt lúa sau 8 ngày cho thấy trong môi trường MS 1/2 tỉ lệ nảy mầm cũng như khả năng tăng trưởng của cây mầm cao hơn so với các môi trường còn lại.Môi trường MS 1/2 được chọn để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo (bảng 3.1).
Bảng 3.1. Chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ cây mầm lúa sau 8 ngày cấy
và tỉ lệ nảy mầm ở các môi trường nuôi cấy khác nhau. Môi trường Chiều cao phần khí sinh (cm) Chiều dài rễ (mm) Tỉ lệ nảy mầm (%) MS 64,33 ± 0,49a 21,89 ± 0,19a 80,02± 0,41b MS 1/2 172,11 ± 0,73b 71,89 ± 0,19b 98,03± 0,57c MS 1/5 70,04 ± 0,1a 25,78 ± 0,15a 80,02± 0,45b MS 1/10 66,00 ± 1,14a 22,44 ± 0,25a 40,04± 0,32a
Các số trung bình theo cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
3.1.2. Thời gian bão hòa nước của hạt
Sau khi ngâm hạt lúa trong môi trường MS 1/2, hạt lúa tiếp tục gia tăng trọng lượng tươi. Đến 4,5 giờ sau hạt đạt trạng thái bão hòa (bảng 3.2).
Bảng 3.2. Sự thay đổi trọng lượng tươi của hạt lúa được ngâm trong môi trường MS 1/2.
Thời gian (giờ) Sự thay đổi trọng lượng hạt(g)
0 5,00 ± 0,02a 0,5 5,35 ± 0,04b 1 5,36 ± 0,01c 1,5 5,38 ± 0,03d 2 5,45 ± 0,01e 2,5 5,53 ± 0,01f 3 5,57 ± 0,02g 3,5 5,62 ± 0,02h 4 5,70 ± 0,03i 4,5 5,80 ± 0,02k 5 5,80 ± 0,02k 5,5 5,80 ± 0,02k
Các số trung bình theo cột với các mẫu tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05
3.1.3. Sự nảy mầm và tăng trưởng in vitro của cây mầm lúa
Hạt lúa được cấy vào môi trường MS 1/2. Sau 1 ngày, hạt bắt đầu nảy mầm, xuất hiện sơ khởi chồi và rễ là phần hơi u ra ở phôi kích thước 1mm (ảnh 3.2). Tỉ lệ nảy mầm của các hạt lúa trên môi trường nuôi cấy đạt khoảng 98%. Cây mầm lúa nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 có chiều dài phần khí sinh, chiều dài rễ, chiều dài phiến lá và bẹ lá tăng từ ngày 4 đến ngày 8 (bảng 3.3). Cây mầm ở ngày 4 xuất hiện lá mầm đầu tiên, lá này là lá giả và không tính vào số lá của cây lúa (ảnh 3.3). Cây mầm ở ngày 6 chỉ có 1 rễ và thân
thẳng, màu xanh (ảnh 3.4). Cây mầm ở ngày 8 xuất hiện lá thật đầu tiên và rễ phát triển nhiều hơn (ảnh 3.5).
Lát cắt ngang cực chồi và cực rễ cây mầm ở ngày 1 cho thấy có sự phân hóa các tế bào giúp phát triển chồi và rễ (ảnh 3.6 - 3.8).
Ảnh 3.8 cho thấy sơ khởi rễ bắt đầu xuất hiện, sau đó tiếp tục kéo dài (ảnh 3.9, 3.10) và tạo rễ mầm (ảnh 3.11).
Bảng 3.3. Sự tăng trưởng cây mầm lúa sau 8 ngày nuôi cấy
trên môi trường MS 1/2.
Chỉ tiêu tăng trưởng cây mầm Thời gian sau khi cấy (ngày)
4 6 8
Chiều cao phần khí sinh (mm) 6,00 ± 0,151 53,50± 2,042 172,50 ± 3,353
Chiều dài bẹ lá (mm) 0,00 ± 0,001 36,33 ± 2,012 109,33 ± 3,533 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chiều dài phiến lá (mm) 0,00 ± 0,001 17,17 ± 3,382 63,17 ± 3,003
Chiều dài rễ (mm) 10,22 ± 0,231 48,50 ± 2,722 71,83 ± 3,243