Các hạt lúa in vitro được nuôi cấy trong môi trường MS 1/2 trong điều kiện nuôi cấy bình thường hoặc có xử lý được chụp hình và được cắt ngang hoặc cắt dọc bằng tay hoặc bằng máy cắt vi phẫu (microtome), sau đó được nhuộm hai màu bằng phẩm nhuộm đỏ carmine - xanh iod và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
* Cắt bằng tay
Mẫu được cắt bằng tay theo chiều dọc hoặc chiều ngang. Mẫu được ngâm javen trong 20 phút rồi rửa lại 3 lần bằng nước cất. Sau đó ngâm mẫu trong axit acetic 20% trong 15 phút rồi rửa lại bằng nước cất 3 lần. Sau cùng nhuộm mẫu và quan sát mẫu.
* Cắt bằng máy cắt microtome
Mẫu được cố định ngay trong môi trường FAA (phụ lục). Sau 24 giờ, chuyển mẫu vào etanol 700
. 2.Đúc mẫu
Loại nước bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: -Etanol 700: 3 lần, mỗi lần 20 phút. -Etanol 950: 3 lần, mỗi lần 20 phút. -Etanol 1000: 3 lần, mỗi lần 20 phút. Loại etanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong:
-Butanol 1: 30 phút. -Butanol 2: 30 phút. -Butanol 3: 60 phút.
-Butanol 4: 10 giờ hoặc qua đêm.
Loại butanol bằng cách đặt mẫu lần lượt trong paraffin tan ở 56 - 600 C: -Paraffin 1: 1 giờ.
-Paraffin 2: 1 giờ. -Paraffin 3: 1 giờ.
Đổ paraffin nóng chảy vào khuôn, đặt mẫu vào và đổ đầy paraffin. 3.Cắt và dán mẫu
Mẫu được cắt dọc hoặc cắt ngang thành từng lát mỏng 7 μm nhờ máy cắt microtome. Băng paraffin có chứa mẫu được cắt thành từng đoạn ngắn và được dán lên lam chứa dung dịch gelatin 1%. Đặt mẫu trên bếp ở nhiệt độ khoảng 350C. Mẫu giãn ra dán chặt vào lam. Giữ mẫu trong tủ ấm ở 300
C trong hai ngày để cho mẫu thật khô.
4.Loại parafin
Loại parafin bằng cách đặt mẫu lần lượt trong: -Metylcyclohexan 1: 10 phút.
Rửa mẫu bằng etanol 1000. Sau đó, đặt mẫu lần lượt trong: -Etanol 1000: 5 phút.
-Etanol 950: 5 phút. -Etanol 700: 5 phút. -Nước cất: 5 phút.
5. Nhuộm mẫu và quan sát mẫu. (Lê Thị Trung 2003)
2.2.4. Khảo sát sự nảy mầm và tăng trưởng in vitrocủa cây mầm lúa
Hạt lúa sau khi tách vỏ trấu được rửa bằng cồn 700 trong 1 phút, rồi ngâm trong natri hypoclorit 4% trong 30 phút. Sau đó, cấy hạt vào ống nghiệm trong điều kiện vô trùng. Môi trường được chọn từ kết quả thí nghiệm mục 2.2.1 (MS 1/2). Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20
C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt với 3 lần lặp lại.
Quan sát sự nảy mầm của hạt và theo dõi sự tăng trưởng của cây mầm sau 8 ngày nuôi cấy qua các chỉ tiêu:
Chiều cao phần khí sinh như mục 2.2.1
Chiều dài bẹ lá được đo từ gốc đến mắt phần gối bẹ ở lá dài nhất. Chiều dài phiến lá được đo từ gối bẹ đến đỉnh lá của lá cao nhất. Chiều dài rễ như mục 2.2.1.
Số lá được tính là số lá có trên cây ở thời điểm khảo sát. Số rễ được tính là số rễ có trên cây ở thời điểm khảo sát.
2.2.5. Khảo sát thời điểm gây stress ngập úng in vitro ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây mầm lúa sự tăng trưởng của cây mầm lúa
Hạt lúa sau khi được cấy vào ống nghiệm chứa môi trường MS 1/2, tiến hành gây ngập nước cho cây vào các thời điểm khác nhau ở mỗi nghiệm thức là 0 giờ, 5 giờ, 10 giờ, 15 giờ và 24 giờ với chiều cao cột nước thay đổi ở mỗi nghiệm thức là 0 mm (không bổ sung nước), 1 mm, 15 mm, 30 mm. Ống
nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm.Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux.Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt lúa, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại.
Theo dõi cây mầm ở các điều kiện ngập nước qua các chỉ tiêu: chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ. Đối chứng với cây mầm trong môi trường MS 1/2 và ghi nhận kết quả sau 4 ngày cấy.
Thời điểm gây stress thích hợp sẽ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.6. Khảo sát ảnh hưởng của mực nước ngập úng in vitro đến sự
tăng trưởng của cây mầm lúa
Từ kết quả tìm hiểu thời điểm gây stress ảnh hưởng đến sự tăng trưởng cây mầm lúa ở mục 2.2.5, tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của các mực nước khác nhau đến sự tăng trưởng cây mầm lúa.
Hạt lúa được cấy vào môi trường MS 1/2 sau 24 giờ được gây ngập úng. Các nghiệm thức về chiều cao cột nước được chọn như sau: 0 mm, 0,5 mm, 1mm, 3 mm, 15 mm, 30 mm, 75 mm, 120 mm. Ống nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20
C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt lúa, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại.
Theo dõi cây mầm ở các điều kiện ngập nước qua các chỉ tiêu: chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ. Đối chứng với cây mầm trên môi trường MS 1/2 và ghi nhận kết quả sau 4 ngày nuôi cấy.
Mực nước gây stress thích hợp sẽ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.7. Khảo sát sự nảy mầm và tăng trưởng của cây mầm trong điều
kiện ngập úng in vitro
nước ngập úng in vitro ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của cây mầm, tiếp tục khảo sát sự tăng trưởng của cây mầm trong điều kiện ngập úng in vitro.
Hạt lúa được cấy trong môi trường MS 1/2, sau 24 giờ (mục 2.2.5) được gây ngập với chiều cao mực nước 15 mm (mục 2.2.6). Ống nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20
C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt với 3 lần lặp lại.
Quan sát sự nảy mầm của hạt qua 8 ngày nuôi cấy và theo dõi các chỉ tiêu chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ, số lá, số rễ.
2.2.8. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý nhiệt độ đến sự tăng
trưởng của cây mầm lúa trong điều kiện ngập úng in vitro
Để theo dõi sự kháng chéo của cây mầm lúa trong điều kiện ngập úng, yếu tố nhiệt độ 450
C và thời gian xử lý nhiệt độ 450
C được khảo sát.
Hạt lúa được cấy vào môi trường MS 1/2, sau 24 giờ được bổ sung 15 mm nước. Sau đó, các hạt lúa được xử lý 450
C bằng cách đặt các ống nghiệm trong tủ nhiệt với thời gian khác nhau là 0 phút, 30 phút, 60 phút, 120 phút. Ống nghiệm được sử dụng có đường kính là 25 mm. Điều kiện nuôi cấy: nhiệt độ 25 ± 20C, ánh sáng 2000 ± 200 lux. Mỗi ống nghiệm cấy 1 hạt lúa, mỗi nghiệm thức gồm 3 ống nghiệm với 3 lần lặp lại.
Theo dõi cây mầm ở các điều kiện xử lý qua các chỉ tiêu: chiều cao phần khí sinh, chiều dài rễ. Đối chứng với cây mầm trong môi trường MS 1/2 ngập 15 mm không kèm nhiệt độ (0 phút) và ghi nhận kết quả sau 6 ngày nuôi cấy.
Thời gian thích hợp để xử lý 450C sẽ được chọn cho các thí nghiệm tiếp theo.
2.2.9. Xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô
Cây mầm lúa qua 4, 6, 8 ngày được nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 có hoặc không gây ngập úng, hoặc ngập úng kèm xử lý 450
C (15 mm - 450C) được xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô để khảo sát sự tăng
trưởng. Mẫu được lấy ra khỏi ống nghiệm, rửa sạch, thấm khô và cân để xác định trọng lượng tươi. Sấy mẫu trong 6 giờ ở 800C để loại nhanh hoạt động của enzym sau đó sấy mẫu liên tục ở 600C cho đến khi trọng lượng không đổi và cân để xác định trọng lượng khô (Bùi Trang Việt 1992). Ghi nhận kết quả sau 3 lần cân ở mỗi mẫu.
2.2.10. Đo hàm lượng đường và hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa
Hàm lượng đường và hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa ở 0, 4, 8 ngày sau khi nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 có hoặc không gây ngập úng hoặc ngập úng kèm xử lý 450C được ly trích và đo để khảo sát khả năng thích nghi của cây mầm trong điều kiện stress.
Xây dựng đường chuẩn
Dung dịch sucaroz và glucozo được pha chế theo các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µg/l. Nhuộm dung dịch đường bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ dung dịch đường : phenol : H2SO4 đậm đặc là 1 : 1 : 5 theo thể tích.
Sau khi nhuộm màu dung dịch đường, lắc đều, để yên 15 phút, tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm. Thu các giá trị đo được và vẽ đường chuẩn của sucaroz và glucozo theo 10 nồng độ khác nhau.
Đo hàm lượng đường trong cây mầm lúa
Cân 1 g trọng lượng tươi cây mầm rồi nghiền với 10 ml cồn 960, đun sôi cách thủy lọc lấy phần dịch. Phần bã ly trích với cồn 800 (lặp lại hai lần). Phần dịch được làm bay hơi bằng cách đun cách thủy cho cô cạn dung dịch, rồi pha loãng với nước theo một thể tích nhất định, ta thu được dịch trích đường.
Dịch trích đường được cho phản ứng với phenol 5% và H2SO4 đậm đặc (theo tỉ lệ 1 : 1 : 5).
Hàm lượng đường được tính bằng cách so sánh với đồ thị đường cong chuẩn sucaroz.
Đo hàm lượng tinh bột trong cây mầm lúa
Cân 1g trọng lượng tươi cây mầm rồi nghiền với 10 ml cồn 960, đun sôi cách thủy lọc lấy phần dịch. Phần bã ly trích với cồn 800 (lặp lại hai lần). Phần bã có chứa tinh bột được sấy ở nhiệt độ 600C. Đun cách thủy phần bã với 5 ml nước cất trong 15 phút, để nguội. Thêm 2 ml HClO4 9,2 N, khuấy đều trong 15 phút. Thêm nước cất vào cho đủ 10 ml và ly tâm 4000 vòng trong 30 phút. Thu được dịch lỏng 1.
Phần bã tiếp tục ly trích với 2 ml HClO4 4,6 N, khuấy đều trong 15 phút. Pha loãng thành 10 ml rồi ly tâm như trên. Thu được dịch lỏng 2, gộp chung dịch lỏng 1 và 2. Đem dung dịch tinh bột thu được pha loãng với nước theo một thể tích nhất định.
Dung dịch tinh bột được cho phản ứng với phenol 5% và acid sulfuric đậm đặc (theo tỉ lệ dung dịch đường : phenol : H2SO4 đậm đặc là 1 : 1 : 5).
Đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm. Tính hàm lượng đường glucozo theo đường chuẩn glucozo.
Hàm lượng tinh bột được tính theo công thức:
a : lượng đường glucozo sau khi phân giải b : độ pha loãng
0,9 : hệ số chuyển đổi
n : trọng lượng mẫu được phân tích
2.2.11. Đo cường độ hô hấp
Cây mầm lúa 0, 4, 8 ngày sau khi nuôi cấy trên môi trường MS 1/2 (đối chứng), MS 1/2 có ngập úng 15 mm hoặc ngập úng 15 mm kèm xử lý 450
C (15mm - 450C), được đo cường độ hô hấp bằng máy Warburg. Điều kiện đo:
nhiệt độ 25 ± 10C, trong tối.
- Cân 1 g trọng lượng tươi cây mầm, đựng trong nước cất.
- Cho vào thân bình Warburg 2 ml nước cất. Cho vào trụ giữa 0,5 ml dung dịch KOH 20%. Dùng kẹp cho mảnh giấy lọc đã được gấp nếp vào trụ giữa, sau đó cho các cây mầm vào thân bình (1 g cây mầm/bình). Thực hiện một bình nhiệt – khí – áp kế với 2,5 ml nước cất (không có mẫu vật).
Thoa vaselin vào mặt trong cổ bình, ống nhánh, đậy kín nút ống nhánh. Gắn bình Warburg vào áp kế. Gắn áp kế này vào thành máy Warburg, thân bình ngập trong nước. Mở khóa chia ba để áp kế thông với khí quyển.
- Cho lắc 10 phút. Điều chỉnh mực chất lỏng trong áp kế đến vạch 150. - Đóng khóa áp kế để hệ thống bình Warburg và nhánh áp kế hoàn toàn kín. Mở máy lắc, ghi thời điểm bắt đầu đo. Sau 15 phút ngừng máy lắc, điều chỉnh mực chất lỏng trong nhánh kín của áp kế về vạch 150. Đọc trị số ∆P bằng số mm chất lỏng Brodie chênh lệch giữa hai nhánh áp kế. Tính trị số ∆V ở bình qua hệ thức ∆V = K. ∆P. Từ đó, tính cường độ hô hấp của khúc cắt (µO2/g trọng lượng tươi/giờ).
Cường độ hô hấp của các cây mầm là giá trị của 3 lần lặp lại cho mỗi thời điểm tăng trưởng của cây mầm.
(Nguyễn Du Sanh và cs, 2011)
2.2.12. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong cây mầm lúa
Cây mầm lúa sau 0, 4, 8 được nuôi cấy trong môi trường MS 1/2 (đối chứng), MS 1/2 có ngập úng 15 mm hoặc ngập úng 15 mm kèm xử lý 450
C, được ly trích và đo các chất điều hòa tăng trưởng thực vật.
Ly trích và phân lập
Để ly trích và phân lập các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, người ta thay đổi pH của dịch hòa tan và dùng các dung môi thích hợp (ete, butanol
bão hòa nước), trước khi áp dụng phương pháp sắc ký.
Nghiền 1 g cây mầm, thêm 20 ml metanol 80%, để trong tối ở nhiệt độ phòng. Sau 24 giờ, lọc hỗn hợp thu lấy dịch lọc. Lọc thêm 2 lần nữa với 20 ml metanol 80% mỗi lần. Cô cạn dịch lọc dưới quạt. Thêm 5 ml nước cất vào phần dịch cô cạn, chỉnh pH 2,5 bằng dung dịch HCl 1%. Dịch lọc được chuẩn trên giấy sắc kí. Sơ đồ ly trích và phân đoạn như ảnh 2.1.
Sắc ký
Đặt bản silicagel 60 F254 (20 x 20 cm) (Merck) đã được chấm sắc ký vào thùng sắc ký chứa dung môi di chuyển chloroform : metanol : acid acetic (80 : 15 : 5 theo thể tích). Khi mức dung môi di chuyển còn cách mép trên của bản sắc ký khoảng 1 cm, quá trình chạy sắc ký kết thúc. Đèn UV 254 nm và 320 nm được sử dụng để xác định vị trí chất điều hòa tăng trưởng thực vật chuẩn. Từ đó xác định vị trí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đã được ly trích.
Xác định hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng cách sinh trắc nghiệm
Sau sắc ký, các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được xác định tương ứng với mỗi băng trên bản silicagel nhờ giá trị Rf của mỗi chất chuẩn. Các ô tương ứng với từng mẫu trên mỗi băng được cắt riêng, cạo, ngâm với nước cất sau 24 giờ, được dùng trong sinh trắc nghiệm. Dung dịch chứa mỗi loại hormon thực vật/mẫu được chia làm ba phần. Mỗi phần là một lần lặp lại trên một erlen hoặc đĩa petri.
Sinh trắc nghiệm auxin và acid abscisic
Hoạt tính auxin và acid abcisic được xác định nhờ sinh trắc nghiệm diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Hạt lúa được ngâm trong nước ấm 24 giờ và gieo trên gòn ẩm, trong tối. Sau 96 giờ, diệp tiêu (chưa bị xé) được cô lập được cắt thành đoạn dài 2 mm để dùng trong sinh trắc nghiệm. Mỗi nghiệm thức gồm 10 khúc cắt diệp tiêu được cho vào mỗi đĩa petri chứa 5 ml dung dịch ly trích
ở điều kiện tối, nhiệt độ 280C. Sau 24 giờ, hoạt tính tương đương của auxin và acid abcisic được xác định dựa vào sự sai biệt của chỉ số tăng trưởng chiều dài của diệp tiêu giữa các dịch trích, nước cất, dung dịch AIA 1 mg/l và ABA 1 mg/l.
Sinh trắc nghiệm cytokinin
Hoạt tính cytokinin được đo bằng sinh trắc nghiệm tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.). Hạt dưa leo được ngâm trong nước ấm 2 giờ, cho nảy mầm sau 24 giờ và khi rễ mầm nhú ra khoảng 2 mm thì tử diệp được cắt ra để