3. Dung dịch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit): (0,5M; pH 8,0; 100 ml)
15.3.3. Vận hành điện d
1. Làm lạnh nền trước khi tiến hành, đặc biệt khi dùng điện áp cao hơn hoặc khi sự phân ly quy định trên 30 phút.
Chú ýï: Để tiến hành phân ly, hoặc là thêm 0,5 mg/ml etydi bromua vào dung dịch đệm hoặc thêm 50 mg/ml etydi bromua vào bộ đệm mẫu. Để quan sát, hãy cắt điện, tháo phần nắp và giữ đèn cực tím gần gel.
Thêm từ từ etydi bromua vào dung dịch đệm hay đệm mẫu. Phát hiện bằng phương pháp này khơng nhạy bằng cách nhuộm màu và nhìn qua thiết bị soi.
2. Đổ dung dịch vào các khoang sao cho đến khi đệm cao hơn gel khoảng 1 mm (khoảng 220 ml).
3. Nạp mẫu. Thêm mẫu vào 5X bộ đệm tải mẫu và trộn (1/5 thể tích là đệm nạp vào). Sử dụng micropipet để nạp mẫu, chú ý tránh đâm thủng hoặc tạo nên nhiều bong bĩng.
4. Đặt nắp để catot (−, dây đen) ở đoạn cuối gần mẫu nhất. (Mẫu axit nucleic di chuyển về phía anơt, +, dây đỏ). Nối các dây màu (đỏ với đỏ, đen với đen) tới các nguồn điện, như là ESP 2A200. Đặt mức điện áp và thiết bị bấm giờ (nếu cĩ sẵn) theo mức độ phân ly.
Mặt sau lược Ốc (2)
Nhanh, điện áp cao
Những ứng dụng nào đĩ, như là kiểm tra các mẫu, cĩ thể thực hiện nhanh dưới điều kiện điện áp cao. Làm lạnh (−200
C ) và giới hạn thời gian vận hành 5 phút hoặc ít hơn ở điện áp 500 V.
Chậm hơn, điện áp cao hơn
Một gradient điện áp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phút (sử dụng dung dịch đệm 1% gel agaroza và 0,5 X TBE) cắt Hind III của lamda ADN thành các đoạn 0,1 ÷ 23 kb. Hoặc, dùng dung dịch như vậy, mẫu này cĩ thể chạy ở 24 V/cm (300V) thì cĩ thể phân cắt trong 20 ÷ 30 phút. Làm lạnh thiết bị trước khi tiến hành.
Chú ý:
- Nếu khơng đổ thêm màu vào chất lỏng làm nguội thì đặt trên nền tối để quan sát dễ dàng hơn.
- Đặt thiết bị cịn nĩng lên nền được làm lạnh cĩ thể ảnh hưởng đến nhiệt độ xung quanh. Nếu sự quá nhiệt khơng được kiểm sốt, gel sẽ tan hoặc thiết bị sẽ cong.
- Etydi bromua là chất ăn da mạnh, nên cần mang bao tay. - Đeo kính chắn tia UV và bảo vệ da khi sử dụng đèn UV.
- Tính gradient điện áp, chia điện áp đặt vào cho khoảng cách giữa các cực 12,7 cm.
Bảng 15.2. Điện áp đặt vào và thời gian đề nghị (1)
Điện áp, V Gradient, V/cm Thời gian, phút
500 40 5 (1)
400 31 10 (1)
300 24 20 (1)
200 16 30 ÷ 40
150 12 30 ÷ 60
Ghi chú: (1) Để thời gian chạy ít hơn hoặc bằng 20phút, sử dụng 0,5X TBE và làm lạnh
nền đến −200C trước khi sử dụng.
Sau khi phân ly
1- Ngắt điện, tháo dây dẫn, tháo nắp.
2- Nếu khơng thêm etydi bromua vào gel hoặc mẫu trước khi chạy, nhuộm gel trong dung dịch 0,5 ÷ 1 mg/ml etydi bromua trong nước hoặc đệm.
328
Vận hành
Các loại gel agaroza được chuẩn bị lần đầu trong khuơn đúc gel. Những mẫu được nạp vào trong các bể chứa và được phân ly. Thuốc nhuộm huỳnh quang C12H20BrN3 cĩ thể được thêm vào chất đệm điện di hoặc gel hoặc cả hai để tìm ra dấu hiệu của quá trình phân ly. Sau khi điện di, gel cĩ thể cho màu, ghi lại màu, thấm màu thêm hoặc sấy tự động.
- Đổ đầy lỗ với chất tải lạnh. Dù khơng làm lạnh đi nữa thì điều quan trọng là phải đổ đầy lỗ với dung dịch làm lạnh đặc trưng trước khi sử dụng vì dung dịch cung cấp nguồn nhiệt cần thiết.
Chuẩn bị 600 ml với 50/50 C2H2(OH)2/H2O
- Để giúp xem các bể chứa được rõ ràng hơn trong khi nạp mẫu, thêm 1 hoặc 2 giọt thuốc nhuộm hồ tan hoặc màu thực phẩm vào dung dịch làm lạnh.
Tìm ra hai lỗ hỏng nạp nước ở phần trên của lỗ. Đổ đầy lỗ hỏng đến mức cĩ thể như chất làm lạnh bằng ống phun hoặc máy bơm với 50 ml.
Bấm nút caosu màu nâu vào mỗi lỗ.
- Sắp xếp dung dịch đã chuẩn bị trong thùng đá hoặc bên trong máy lạnh hoặc tủ lạnh để khơng dưới 200C trong khoảng 1 giờ trước khi sử dụng (hố chất được dự trữ trong phịng lạnh hay tủ lạnh).
Chú ý: - Khơng đổ đầy lỗ với chất chống đơng thương mại, dung mơi hữu cơ hoặc nước cất.
- Khơng cần thiết thay thế chất làm lạnh.