3.5.1.1. Chuẩn bị dịch thử
Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:
- Phần 1: Bột nấm Linh Chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
Quan sát kết tủa, nếu cĩ kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu khơng cĩ kết tủa, chưa thể kết luận là khơng cĩ alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.
- Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (mơi trường phải cĩ tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phịng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung mơi đến cạn, thu được cặn. Hịa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
3.5.1.2. Thuốc thử định tính alcaloid
Thuốc thử Mayer: Hịa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid lỗng cĩ chứa alcaloid, nếu cĩ alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành cĩ thể hịa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hịa tan bởi ethanol cĩ sẵn trong dung dịch thử.
- Thuốc thử Dragendorff: Hịa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml HNO3 30% (D=1,18). Hịa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất.
Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, cĩ thể giữ lâu vài tuần.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid lỗng cĩ chứa alcaloid, nếu cĩ alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.
3.5.2. Phương pháp xác định hợp chất saponin (Trần Hùng, 2004)
Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cơ dịch lọc bốc hơi đến cắn khơ. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính.
3.5.2.1. Thử nghiệm tính tạo bọt
Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin.
Cách tiến hành: Hịa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml nước nĩng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dùng ngĩn tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:
Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++
3.5.2.2. Thử nghiệm Fontan – Kaudel
Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nĩng nhẹ trên cách thủy để hịa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13)
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bĩng trong cả 2 ống nghiệm.
định là cĩ saponin triterpenoid.
- Nếu ống pH = 13 cĩ cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH =1, sơ bộ xác định là cĩ saponin steroid.
3.5.3. Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard)
Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nĩn, trong 10– 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi khơng cịn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cơ lại đến khi cịn khoảng 50 ml dịch chiết ether.
Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hịa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khơ, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch cĩ màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục hay tím. Kết luận cĩ triterpenoid
3.5.4. Định tính acid hữu cơ
Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri Na2CO3. Nếu cĩ các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể Na2CO3 thì kết luận là cĩ acid hữu cơ.
3.6. Định lượng polysaccharides (GLPs) (Yihuai Gao và ctv, 2001)
Polysaccharide cĩ nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở100oC trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides cĩ trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs.
Thu nhận cả 3 dịch chiết và đem đi lọc. Lấy phần cặn (dịch lơ lửng sau khi lọc) đem đi sấy khơ và cân trọng lượng. Từ đĩ đánh giá hàm lượng polysaccharide
thơ cĩ trong quả thể nấm Linh chi .
2.5. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý ANOVA, sử dụng trắc nghiệm phân hạng LSD/ DUNCAN bằng phần mềm SAS 9.1.
Sử dụng Microsofl Excel 2003 để vẽ đồ thị.
Chương 3
K T QU VÀ TH O LU NẾ Ả Ả Ậ
3.1. Ảnh hưởng của mơi trường nhân giống cấp 1 thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của hệ sợi nấm Ganoderma licidumphát triển của hệ sợi nấm Ganoderma licidumphát triển của hệ sợi nấm Ganoderma licidum phát triển của hệ sợi nấm Ganoderma licidum
Với chủng Ganoderma licidum được đem phân lập thì sau 2-3 ngày khi tách mơ nấm sạch lên mơi trường thạch, những mẫu khơng bị nhiễm thì xuất hiện sợi nấm bung ra bao phủ bề mặt mơ nấm phân lập. Tiếp tục theo dõi hệ sợi phát triển, và đo đạc ta được bảng số liệu dưới đây. Hệ sợi của các giống nấm trên mơi trường. PGA, PGA cải tiến, Mizuno, Czapek – Dox được khảo sát 2 ngày/ lần ở nhiệt độ phịng (200±2).
Trên mơi trường thạch, hệ sợi nấm Linh chi phát triển dưới dạng hình rễ khá sớm và tốc độ tương đối nhanh. Trong quá trình theo dõi sự sinh trưởng của hệ
PGA
sợi nấm Linh chi, nhận thấy trong 2 ngày đầu hệ sợi tăng trưởng rất chậm. Sau 3 ngày thì trên mơi trường PGA và PGA cải tiến đều xuất hiện lớp sắc tố màu đỏ nâu được nấm tiết ra ở gốc cấy ban đầu và lan dần đều ra xung quanh bề mặt thạch. Thời gian xuất hiện lớp sắc tố trên mơi trường Mizuno là khoảng 5 ngày.
Xung quanh rìa khuẩn lạc là hệ sợi nấm đang tăng trưởng, màu trắng - đục và phía bên trong rìa khuẩn lạc cĩ màu đỏ - nâu.
Hình 3.1 : Đường kính khuẩn lạc của hệ sợi nấm Garnoderma licidum trên các mơi trường thạch ở 4 NSC.
Hình 3.2: Đường kính khuẩn lạc của hệ sợi nấm Garnoderma licidum trên các mơi trường thạch ở 8 NSC Czapeck- Dox Mizuno PGA c i ti nả ế PGA c i ti nả ế Mizuno Czapek- Dox PGA
Bảng 3.1: Ảnh hưởng của mơi trường nhân giống cấp 1 đến đường kính khuẩn lạc (cm)
của hệ sợi nấm Garnoderma licidum
Mơi trường 2 NSC 4 NSC 6 NSC 8 NSC
PGA cải tiến 3,31 a 5,19 a 6,52 a 7,27 a
Czapek-Dox 3,23 a 3,63 c 4,94 bc 5,33 c
Mizuno 2,41 b 3,53 c 4,70 c 5,23 c
PGA(Đ/c) 3,50 a 4,37 b 5,31 b 6,61 b
CV(%) 3,49 3,07 4,01 2,40
Ftính 59,17** 108,16** 42,24** 140,62**
Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu cĩ cùng ký tự đi kèm khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; ns: khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; **: khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê mức 0,01; *: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê mức 0,05.
Qua kết quả thống kê cho thấy đường kính lan tơ của khuẩn lạc nấm Linh chi trên các mơi trường nhân giống cấp 1 ở 2 NSC, 4 NSC, 6 NSC và 8 NSC khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,01):
Ở 2 NSC, đường kính khuẩn lạc nấm Linh chi trên các mơi trường nuơi cấy biến động trong khoảng từ 2,41-3,50 cm. Trên mơi trường PGA (ĐC) đường kính khuẩn lạc lớn hơn so với các mơi trường cịn lại (3,5 cm). Tuy nhiên, qua trắc nghiệm phân hạng LSD cho thấy đường kính khuẩn lạc trên mơi trường PGA chỉ cĩ sự khác biệt so với mơi trường Mizuno (2,41 cm) nhưng khơng cĩ sự khác biệt so với 2 mơi trường cịn lại, đường kính khuẩn lạc trên mơi trường Czapek-Dox và PGA cải tiến lần lượt là 3,23 cm và 3,31 cm.
Ở 4 NSC, đường kính khuẩn lạc của nấm Linh chi trên mơi trường PGA cải tiến là lớn nhất trong các mơi trường nuơi cấy, đường kính khuẩn lạc đạt 5,19 cm và lớn hơn so với mơi trường đối chứng (4,37 cm). Trong khi đĩ, ở mơi trường Mizuno đường kính khuẩn lạc là bé nhất (3,53 cm).
Ở 6 NSC, đường kính khuẩn lạc của nấm Linh chi ở các mơi trường nhân giống cấp 1 biến động từ 4,70 – 5,52 cm. Theo kết quả phân hạng cho thấy ở mơi trường
PGA cải tiến cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa so với các mơi trường nhân giống cấp 1 cịn lại, mơi trường PGA cải tiến cĩ đường kính khuẩn lạc lớn nhất (5,52cm) và mơi trường Mizuno cĩ đường kính khuẩn lạc bé nhất (4,70cm), kế đến là các mơi trường Czapeck– Dox và PGA (ĐC) cĩ đường kính khuẩn lạc lần luợt là 4,94 cm và 5,31 cm.
Ở 8 NSC, đường kính của khuẩn lạc trên mơi trường PGA cải tiến lớn hơn so với các nghiệm thức cịn lại trong thí nghiệm đường kính khuẩn lạc là 7,32 cm (bảng 3.1) và cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,01). Ở mơi trường Mizuno đường kính khuẩn lạc vẫn bé nhất (5,23cm).
Các chủng nấm Linh chi khác nhau thời gian tơ nấm phủ kín đĩa pertri cũng khác nhau. Theo Nguyễn Minh Khang (2005) khi tiến hành phân lập chủng nấm Linh chi đen trên mơi trường PGA ở 6 NSC tơ nấm đã lan kín đĩa pertri, trong khi đĩ khi tiến hành phân lập chủng nấm Linh chi đỏ Đà lạt trên mơi trưng PGA 8 NCS đường kính khuẩn lạc lan kín đĩa petri.
Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Lê Quốc Hùng (2011), khi tiến hành phân lập chủng nấm Linh chi đỏ Đà Lạt trên mơi trường PGA cải tiến ở 8 NSC đường kính khuẩn lạc đo được là 7,32 cm. Kết quả này cũng tương tự như đường kính khuẩn lạc ghi nhận được trên mơi trường PGA cải tiến ở 8 NSC.
0.91 0.67 0.65 0.83 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Czapek-Dox Mizuno cm
Hình 3.3: Tốc độ lan tơ của khuẩn lạc trên mơi trường nhân giống cấp 1 (cm/ngày)
Qua hình 3.3 cho thấy tốc độ lan tơ của khuẩn lạc nấm Linh chi trên mơi trường PGA cải tiến là nhanh nhất (0,91cm/ngày), kế đến là mơi trường PGA (ĐC) tốc độ lan tơ của khuẩn lạc trên mơi trường này đạt 0,83 cm/ ngày. Trên mơi trường Mizuno tốc độ lan tơ của khuẩn lạc là chậm nhất (0,65 cm/ngày).
Trên các mơi trường dinh dưỡng khác nhau, tốc độ tăng trưởng của sợi nấm Linh chi khác nhau. Tốc độ tăng trưởng sợi nấm trên mơi trường Mizuno rất chậm, sau 10 ngày hệ sợi nấm phủ kín mặt thạch đĩa petri. Ngược lại trên mơi trường PGA và PGA cải tiến thì tốc độ lan rất nhanh và sau 8 ngày đa số sợi nấm đã phủ kín mặt thạch đĩa petri. Mặt khác mật độ hệ sợi nấm trên mơi trường PGA và Mizuno rất nhiều, hệ sợi phân nhánh, nhơ lên bề mặt thạch. Trên mơi trường Czapek – Dox thì hệ sợi nấm rất mỏng manh, khơng phân nhánh.
3.2. Ảnh hưởng của mơi trường nhân giống cấp 2 đến sự sinh trưởng của hệ sợi nấm Ganoderma licidumnấm Ganoderma licidumnấm Ganoderma licidum nấm Ganoderma licidum
3.2.1. Ảnh hưởng của mơi trường nhân giống cấp 2 đến chiều dài hệ sợi nấm
Mục đích cấy chuyền giống từ mơi trường cấp 1 sang mơi trường nhân giống cấp 2 giúp giống thích dần với mơi trường nghèo dinh dưỡng hơn và giúp giống khoẻ hơn trước khi cấy chuyền sang mơi trường mùn cưa. Đồng thời làm tăng lượng giống để cấy sang mơi trường mùn cưa.
Mơi trường hạt sau khi hấp trử trùng ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 60 phút, để nguội và tiến hành cấy chuyền giống nấm từ mơi trường thạch sang mơi trường hạt trong tủ cấy vơ trùng. Sau 2 ngày, những lọ thuỷ tinh đã thấy cĩ hiện tượng bung tơ. Tiếp tục theo dõi hệ sợi phát triển, và đo đạc ta được bảng 3.2. Tốc độ phát triển hệ sợi của các giống nấm trên mơi trường hạt được khảo sát 3 ngày/ lần cho đến khi tơ nấm lan kín lọ thủy tinh.
Trên mơi trường nhân giống nhân giống cấp 2, ở 3 ngày hệ sợi nấm Linh chi lan sâu vào khối cơ chất trong lọ thủy tinh với tốc độ tương đối chậm nhưng đồng đều mọi phía. Lúc cịn non sợi nấm cĩ màu trắng đục, sau 12 – 13 ngày hệ sợi lan hết khối cơ chất trong lọ thủy tinh. Mật độ hệ sợi tăng dần theo thời gian. Trong quá trình sinh trưởng hệ sợi nấm, thấy xuất hiện những đốm sắc tố màu đen – nâu ở bề mặt ngồi lọ thủy tinh. Tốc độ lan hệ sợi nấm đo được thể hiện trong bảng 3.2
Kết quả thống kê cho thấy chiều dài hệ sợi nấm Linh chi cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa (p<0,01) giữa các mơi trường nhân giống cấp 2 sau: 3 NSC, 6 NSC, 9 NSC, 12 NSC.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của mơi trường nhân giống cấp 2 đến chiều dài của tơ nấm Linh
chi trên mơi trường nhân giống cấp 2 (cm)
Nghiệm Thời gian theo dõi
Thức 3NSC 6NSC 9NSC 12NSC L 90%+MC5%+ CG5% 2,33 e 3,75 e 5,12 f 6,53 f L 90%+CB5%+ CG5% 2,53 e 4,72 d 6,25 d 7,75 e L 90% + CG 10% 3,38 ab 5,25 c 6,84 c 8,57 d L 75%+MC20%+ CG5% 2,95 c 3,90 e 5,53 e 7,38 e L 75%+MC15%+ CB5%+ CG5% 3,56 a 4,84 d 5,82 e 7,62 e
L75%+CB5%+CB10% 3,63 a 3,63 e 4,76 g 7,32 e L50%+MC40%+CB15%+CG5% 2,48 de 5,08 cd 6,42 d 9,12 c L 50%+MC35%+CB5%+CG10% 2,67 d 4,74 d 5,47 e 8,45 d L 50% +MC 50% 3,24 b 6,57 a 8,24 a 12,46 a L 100%(Đ/c) 3,2 bc 5,94 b 7,56 b 10,54 b CV(%) 3,65 3,07 2,40 2,72 Ftính 55,76** 120,71** 163,46** 171,54**
Ghi chú: Trong cùng một cột, các số liệu cĩ cùng ký tự đi kèm khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; ns: khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; **: khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê mức 0,01; *: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê mức 0,05
Ở 3 NSC, chiều dài lan tơ nấm của NT lúa 75%+cám bắp 15%+cám gạo 10% và NT lúa 75%+mùn cưa cao su 15%+cám bắp 5%+cám gạo 5% là dài nhất, chiều dài tơ nấm lần luợt là 3,63cm và 3,56 cm. NT lúa 90%+mùn cưa cao su 5%+cám gạo 5% chiều dài tơ nấm ngắn hơn so với các nghiệm thức cịn lại (2,33cm).
Ở 6 NSC, trên các mơi trường nhân giống cấp 2 chiều dài tơ nấm biến động từ 3,63 – 6,57 cm. NT lúa 50%+mùn cưa cao su 50% cĩ chiều dài tơ nấm dài nhất (6,57 cm). NT lúa 90%+mùn cưa cao su 5%+cám gạo 5% cĩ chiều dài tơ nấm là ngắn nhất (3,75 cm). NT lúa 100% (Đ/c) chiều dài lan tơ đạt 5,94 cm, chỉ ngắn hơn so với NT lúa 50%+mùn cưa cao su 50% nhưng đều dài hơn các nghiệm thức cịn lại, cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,01).
Ở 9 NSC, chiều dài tơ nấm NT lúa 50%+mùn cưa cao su 50% là dài nhất (8,24 cm), dài hơn so với NT Đ/c ( 7,56 cm). NT lúa 90%+mùn cưa cao su 5%+cám gạo 5% chiều dài tơ nấm là ngắn nhất (6,53 cm).
Ở 12 NSC chiều dài lan tơ nấm Linh chi biến động từ 6,53 – 12,46 cm so với