3.4.4.1. Ảnh hưởng của cơ chất đến số lượng quả thể nấm Linh chi
Sau khi mở nút bịch, hệ sợi nấm vẫn tiếp tục phát triển. Các sợi tơ sơ cấp kết hợp với nhau để hình thành sợi tơ thứ cấp. Các sợi tơ thứ cấp tăng trưởng dẫn đến tạo thành quả thể (Nguyễn Dũng, 2003). Thời gian này dài hay ngắn phụ thuộc vào đặc tính giống và điều kiện nuơi trồng.
Các sợi nấm khi cảm nhận được mơi trường mùn cưa, thì sợi nấm trắng sẽ mọc lan xuống mơi trường, các sợi nấm này ngày càng ken dày hơn và lan xuống sâu hơn mơi trường. Khi sợi nấm lan được 2/3 bịch hoặc lan hết bịch mùn cưa thì ta tiến hành
bỏ nút bơng, rồi phun ẩm dưới dạng sương mù với độ ẩm khơng khí 80-90%. Đến giai đoạn này các sợi nấm ở đầu bịch cĩ hiện tượng cuốn bện kết lại thành núm nhỏ trắng. Từ các núm nhỏ này, các sợi nấm tiếp tục cuốn lại tạo thành núm lớn hơn, mọc kín cổ bịch. Khi núm này đủ lớn (đến giai đoạn già ) tạo thành mầm thể quả thì chúng bắt đầu phát tán tạo thể quả hồn chỉnh. Mục đích của việc phát tán là để cho chúng cĩ được lớp bào tầng, từ đĩ phát tán bào tử nhằm duy trì nịi giống.
Khi hệ sợi nấm phủ đầy bịch (giai đoạn sinh trưởng), chúng bắt đầu chuyển sang giai đoạn phát triển. Trong giai đoạn mới, hệ sợi nấm đan vào nhau và bắt đầu xuất hiện quả thể. Thời gian xuất hiện quả thể ở nghiệm thức MC75%+CG25%+Urê 0,25% MC70%+CG30% và MC90%+ CB5%+CG5% vào khoảng 27- 29 ngày, riêng các nghiệm thức cịn lại thì thời gian xuất hiện quả thể khoảng 30- 32 ngày (bảng 3.6) . Nhìn chung các bịch mơi trường sau khi cấy giống vào đều xuất hiện mầm quả thể và thời gian xuất hiện mầm giữa các mơi trường chênh lệch nhau từ 1- 5 ngày. Qua kết quả phân tích thống kê thời gian xuất hiện quả thể ở các nghiệm thức cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa (p<0.01).
Số chùm quả thể trên các cơ chất trồng nấm Linh chi biến động từ 1, 37 – 1,43 quả thể. Qua kết quả thống kê cho thấy số chùm quả thể giữa các nghiệm thức khác nhau khơng cĩ ý nghĩa .
Hình 3.8: Cơ chất sau 45 NSC Hình 3.9: Cơ chất sau 60 NSC
Nghiệm thức
Thời gian xuất hiện quả thể (ngày) Số quả thể nấm/ bịch NT1 27,6d 1,43 NT2 32,33a 1,37 NT3 31,2ab 1,37 NT4 31,93a 1,33 NT5 29,73bc 1,40 NT6 29,07c 1,37 NT7 30,4bc 1,40 NT8 26,9d 1,40 NT9 29,2c 1,40 CV(%) 2,03 0,23 Ftính 27,86** 8,65ns
Trong cùng một cột, các số liệu cĩ cùng kí tự đi kèm khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; ns: khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê, **: khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 0,01; *: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê mức 0,05.
3.4.4.2. Ảnh hưởng của cơ chất đến độ lớn của nấm Linh chi
Quả thể nấm là kết quả cuối cùng của sự sinh trưởng tơ nấm. khi hệ sợi bện kết lại với nhau mầm quả thể bắt đầu hình thành và phát triển thành cuống nấm và mũ nấm ảnh hưởng của cơ chất lên sự tăng trưởng của cuống nấm.
Chiều dài của cuống nấm ở cơ chất mùn cưa 75 % + cám bắp 10%+ cám gạo 15% (NT6) cĩ giá trị lớn nhất (9,45 cm) và cơ chất Mùn cưa 95%+cám gạo5%+urê 0,1%+DAP 0,2%+SA 0,2% (NT7) cĩ giá trị nhỏ nhất và sự khác biệt giữa các nghiệm thức rất cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,01) (bảng 3.7).
Bảng 3.7: Ảnh hưởng của cơ chất đến chiều dài cuống nấm, đường kính và độ dày tán
nấm Linh chi (cm)
Chiều dài cuống nấm
Đường kính tán nấm
Độ dày tán nấm
NT2 8,48b 8,14bc 1,48c
NT3 8,6b 7,6c 1,62bc
NT4 8,76b 8,2bc 1,55c
NT5 8,42b 7,58c 1,82ab
NT6 9,45a 8,58ab 1,9a
NT7 7,75de 8,33b 2,02a
NT8 7,97cd 9,2a 2,06a
NT9 8,31bc 8,67ab 1,89a
CV(%) 1,87 3,35 5,48
Ftính 41,59 11,01 14,14
Trong cùng một cột, các số liệu cĩ cùng kí tự đi kèm khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; ns: khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; **: khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 0,01; *: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê mức 0,05.
Năng suất nấm được quyết định bởi trọng lượng quả thể. Chính vì thế sự phát triển của quả thể cĩ vai trị rất quan trọng.
Hình 3.12: Đợ dày tán nấm
Bảng 3.8: Ảnh hưởng của cơ chất đến trọng lượng tươi và trọng lượng khơ của nấm
Linh chi Ganoderma licidum
Nghiệm thức
Trọng lượng nấm tươi (g/bịch)
Trọng lượng nấm khơ (g/bịch)
Hiệu suất sinh học(%) NT1 50,23 b 17,92 b 15,22 b NT2 41,53 d 13,76 e 12,58 d NT3 38,51 e 12,48 g 11,67 e NT4 40,19 de 13,87 e 12,18 ed NT5 40,24 de 14,18 d 12,19 ed NT6 48,29 c 16,36 c 14,63 c NT7 38,65 e 12,88 f 11,71 e NT8 52,11 a 18,66 a 15,79 a NT9 47,45 c 16,23 c 14,38 c CV(%) 1,71 0,6 1,71 Ftính 150,4** 1808,5** 150,04**
Trong cùng một cột, các số liệu cĩ cùng kí tự đi kèm khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê; ns: khác biệt khơng cĩ ý nghĩa thống kê, **: khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê ở mức 0,01; *: khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê mức 0,05.
Theo kết quả bảng 3.8 cho thấy trọng lượng nấm Linh chi tươi và khơ ở các nghiệm thức cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa thống kê (p<0,01). Ở cơ chất mùn cưa phối trộn 70% mùn cưa và 30% cám gạo năng suất nấm Linh chi đạt cao nhất so với các nghiệm thức cịn lại: năng suất nấm tươi đạt 52,11g/bịch cơ chất, năng suất nấm khơ đạt 18,66g/ bịch cơ chất (NT8). Kế đến là cơ chất mùn cưa 75% + cám gạo 20%+ urê 0,25% (NT1) năng suất nấm linh chi tươi và khơ lần lượt là 50.23g/ bịch và 17,92g/bịch. Cơ chất mùn cưa 100%+ SA 0,5% + DAP 0,25% (NT3) thu được trọng lượng nấm Linh chi tươi và khơ thấp nhất.
Theo Nguyễn Minh Khang, (2005). Nghiệm thức 2 (cơ chất mùn cưa cao su phối trộn theo tỷ lệ: mùn cưa 95%+cám gạo 5%+urê 0,1%+DAP 0,2%+SA 0,2%) rất thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nấm linh chi đen. Tuy nhiên, khi cấy
chủng nấm linh chi Đà lạt trên cơ chất này năng suất nấm thấp hơn so với các nghiệm thức cịn lại. Năng suất nấm tươi thu được trên cơ chất này năng suất chỉ đạt 38,51g nấm tươi/bịch và 12,54g nấm khơ/bịch.
Theo kết quả nghiên cứa của Lê Trần Hồi Vũ và Trần Đăng Hồ, tiến hành trồng nấm Linh chi đỏ Đà Lạt trên cơ chất mùn cưa cao su 96,5%+ bột bắp 2%+ cám gạo 1,5% năng suất nấm tươi thu được là 47,90 g nấm tươi/ bịch cơ chất, năng suất nấm khơ đạt 15,86 g/ bịch cơ chất.
Qua kết quả thống kê cho thấy hiệu suất sinh học thu được ở các cơ chất tham gian thí nghiệm cĩ sự khác biệt rất cĩ ý nghĩa (p<0,01). Như vậy hiệu suất sinh học ở các cơ chất giao động từ 11,76- 15,79%, ở cơ chất mùn cưa cao su 70% + cám gạo 30% là cao nhất (15,57%). Trong khi cơ chất mùn cưa 100%+ SA 0,5% + DAP 0,25% hiệu suất sinh học thu được là thấp nhất (11,67%)và hiệu suất sinh học đạt được ở các mơi trường thí nghiệm đều cao hơn 11%.
3.5. Khảo sát dược chất cĩ trong hệ sợi nấm và quả thể nấm Linh chi 3.5.1. Định tính Alkaloid3.5.1. Định tính Alkaloid3.5.1. Định tính Alkaloid 3.5.1. Định tính Alkaloid
Tiến hành thí nghiệm như mục 3.5.1.2 kết quả cho thấy trong nấm Linh chi đỏ Đà Lạt cĩ sự hiện diện alkaloid
1 2 3
Hình 3.13: Định tính alcaloid với thuốc thử Mayer
Cho dịch chiết bột nấm Linh chi đen tác dụng với thuốc Dragendorff thì nhận thấy cĩ xuất hiện kết tủa màu cam - nâu ở dạng tủa bơng và từ từ lắng xuống
đáy ống nghiệm.
Ống 1 (đối chứng): Dịch chiết với nước acid
Ống 2: Dịch chiết với nước acid + thuốc thử Dragendorff Ống 3: Nước cất + thuốc thử Dragendorff
1 2 3
Hình 4.14: Định tính alcaloid với thuốc thử Dragendorff
Nhận xét: Dịch chiết nấm Linh chi ở phần 1 đem thử nghiệm với 2 loại thuốc thử Mayer và Dragendorff thì nhận thấy kết quả là dương tính. Đối với dịch chiết ở phần 2 đem thử nghiệm thì kết quả là âm tính:
Bột dược liệu trích với nước – acid: cĩ thể trích hết tất cả các alcaloid ở dạng baz tự do (N sẽ biến thành NH+ tan trong nước), alcaloid dạng thứ cấp N+, dạng N – oxid (N+ -> O), dạng glycosid, alcaloid loại cĩ tính phân cực mạnh, nhưng sẽ trích luơn những hợp chất cĩ chứa nitơ (protein, glycoprotein, nucleotide) … là những hợp chất tuy khơng phải là alcaloid nhưng cĩ thể cho kết quả dương tính với thuốc thử.
Bột dược liệu trích với dung mơi hữu cơ – kiềm sẽ khơng trích được những alcaloid dạng N – oxid, dạng N tứ cấp, dạng tan tốt trong nước. Phương pháp này trích tốt các alcaloid dạng baz tự do cĩ tính phân cực kém và tính baz yếu, cũng như các alcaloid cĩ cấu trúc đặc thù –C=C –N – .
Như vậy hoạt chất alcaloid khơng cĩ trong quả thể nấm Linh chi hoặc cĩ với hàm lượng cực thấp mà phản ứng định tính khơng thể quan sát được.
Tiến hành thí nghiệm như mục 3.5.2.1. Kết quả ghi nhận như sau:
Độ bền của bọt Kết quả
Sau 15 phút +
Sau 30 phút ++
Sau 60 phút +++
Như vậy dược liệu từ sinh khối và quả thể nấm Linh chi đỏ Đà Lạt cĩ chứa hoạt chất saponin
1 2
Hình 3.15: Thử nghiệm tính tạo bọt từ sinh khối nấm Linh chi
Ống 1: dịch chiết dược liệu sau khi lắc Ống 2 (đối chứng): nước cất sau khi lắc
3.5.2.2. Định tính saponine bằng phương pháp Fontan – Kaudel
- Bọt trong cả 2 ống nghiệm bền hơn 15 phút
- Cột bọt trong ống nghiệm 3 cao hơn 3 lần cột bọt trong ống nghiệm 2. Như vậy, trong mơi trường kiềm bọt bền hơn trong mơi trường acid. Sơ bộ kết luận là cĩ saponin steroid.
1 2 3
Hình 3.16: Thử nghiệm saponin tồn phần theo Fontan – Kaudel 3.5.3. Định tính triterpenoid
Kết quả thí nghiệm nhận thấy sinh khối và quả thể nấm Linh chi cĩ chứa hoạt chất triterpenoid (mơi trường chuyển sang màu xanh lục sau khi cho acid H2SO4 đậm đặc vào từ từ).
1 2
Hình 3.17: Định tính triterpenoid bằng phản ứng Liebermann – Burchard
Ống 1(đối chứng): nước cất +acid Ống 2: Dịch chiết + acid đậm đặc
3.5.4. Định tính acid hữu cơ
Na2CO3 và hơ nĩng thì nhận thấy cĩ bọt khí xuất hiện và bay ra. Như vậy, dịch chiết nước từ quả thể nấm Linh chi đen cĩ chứa thành phần acid hữu cơ.
1 2
Hình 3.18: Định tính acid hữu cơ cĩ trong quả thể Linh chi
Ống 1 : Dịch chiết nước + tinh thể Na2CO3 Ống 2 (đối chứng) : Nước cất + tinh thể Na2CO3
3.5.5. Định lượng polysaccharide từ quả thể nấm Linh chi
Tiến hành ly trích polysaccharides từ 15 gam nấm Linh chi đã sấy khơ theo qui trình thí nghiệm. Sau quá trình lọc và sấy khơ thu nhận được 0,263 gam polysaccharide thơ. Như vậy hàm lượng polysaccharide thơ cĩ trong quả thể nấm Linh chi đạt khoảng 1,75%.
Hình 3.19: Sản phẩm bột polysaccharide thơ từ quả thể nấm Linh chi
Kết quả thí nghiệm cho thấy, nấm Linh chi đỏ Đà lạt cĩ các chất: alkaloid, saponin steroid, treterpennoid, acid hữu cơ, polisacchride. Kết quả này phù hợp với
nhiều nghiên cứu của Nguyễn Minh Thư và Lê Duy Thắng (2008), Trịnh Tam Kiệt (2001), Lê Xuân Thám (1996), R. Russell (2006), Cổ Đức Trọng (2003)
Chương 4
K T LU N VÀ Ế Ậ ĐỀ NGHỊ
4.1. Kết luận
- Mơi trường nhân giống cấp 1 thích hợp cho chủng giống linh chi đỏ Đà Lạt : PGA cải tiến, 8 NSC đường kính khuẩn lạc cuả nấm Linh chi đạt 7,27 cm
- Mơi trường nhân giống cấp 2 thích hợp: Lúa 50% + mùn cưa 50%. Ở 12 NSC chiều dài tơ nấm đạt 12,46 cm.
- Cơ chất sản xuất cĩ hiệu suất cao: Mùn cưa 70% + cám gạo 30% và mùn cưa 75% + cám gạo 25%+ urê 0.25%. Năng suất nấm Linh chi tươi đạt 52,11g/bịch cơ chất, năng suất nấm khơ đạt 18,66 g/ bịch cơ chất và hiệu suất sinh học của cơ chất này đạt 15,79%.
- Sinh khối hệ sợi và quả thể Linh chi đỏ Đà lạt (Ganoderma licidum) cĩ chứa các thành phần hĩa học: Saponine, saponin triterpenoid, acid béo và hàm lượng polysaccharide thơ ly trích được trong quả thể nấm Linh chi khoảng 1,75 %.
4.2. Đề nghị
Đề nghị nghiên cứu thêm về: mơi trường nhân giống cấp 1, cấp 2 và cơ chất trồng nống linh chi để xác định những mơi trường tối ưu nhất cho sinh trưởng và phát triển của nấm Linh chi và sớm hồn thiện qui trình trồng nấm tiên tiến tại Bảo Lộc – Lâm đồng.
TÀI LI U TỆ HAM KHẢO
1.Arichi D.S. and Hagashi D.T., 2003. Linh chi nguyên chất và bệnh thời nay (Đồn Sáng dịch). Nhà xuất bản Y học, Hà nội, Việt Nam.
2. Bahukhandi, D. 1990. Effect of various treatments on paddy straw on yield of some cultivated species of Pleurotus. Indian Phytopath. 43: 471-472.
3. Chang, S. T.& Miles, P. G.1988. Pleurotus-A mushroom of broad adaptability. In: Edible mushroom and their cultivation. CBS Publisher & Distribution. Bhola Nath Nagar, Shahdara, Delhi- 1132.pp. 265-275
4. Cổ Đức Trọng, 2009. Sưu tầm và trồng nấm linh chi vàng tại thành phố Hồ Chí Minh. Trong tuyển tập hơị nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2009, Sở KHCN TP HCM, trung tâm Cơng nghệ Sinh học TP HCM, trường Đaị học Khoa học Tự nhiên TP HCM, Đại học Quốc gia TP HCM.
5. Emine I. Erkel. 2009. The effect of different substrate mediums on yield of
Ganoderma lucidum (Fr.) Karst. Journal of Food, Agriculture & Environment Vol.7 (3&4): 841.844.
6. E.Iclal Erkel. 2009. Yield performance of Ganoderma lucidum (Fr.) Karst cultivation on substrates containing different protein and carbohydrate sources. African Journal of Agricultural Research vol.4 (11), pp.1331-1333.
7. Hồ Như Hải, 2011. Giới thiệu về nấm Linh chi.
<URL:ftp:honhuhai.wordpress.com/2011/09/08/giới-thiệu-về-nấm-linh-chi/>
8. Hsieh, C. & Yang, F. 2004. Reusing soy residue for the solid-state fermentation
Ganoderma lucidum. Bioresour. Technol. 91(1): 105-109.
9. Fang, Q. H. & Zhong, J. J. 2002. Effect of initial pH on production of ganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganoderma lucidum. Proc. Biochem. 37 (7): 769-774.
10. Kamal Hossain, Nirod Chandra Sarker, A. J. Kakon, Abdus Salam Khan and Saleh Ahmed. 2009. Cultivation of Reishi Mushroom (Ganoderma lucidum) on Sawdust of Different Tree Species. Bangladesh J. Mushroom.3(2): 1-5. 11. Lê Duy Thắng, 2001. Kỹ thuật nuơi trồng nấm ăn, tập 1. Nhà xuất bản Nơng
nghiệp.
12. Lê Đình Hồi Vũ, Trần Đình Hồ, 2009. Ảnh hưởng cuả cơ chất đến một số đặc điểm sinh học và năng suất của chủng giống nấm Linh chi nuơi trồng tại Thừa Thiên Huế. Tạp chí khoa học và phát triển số 1 (72).
13. Lê Xuân Thám, 1996. Nghiên cứu đặc điểm sinh học và đặc điểm hấp thu khống nấm Linh chi Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr).Karst. Luận án phĩ tiến sỹ khoa học sinh học, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà nội, Việt Nam.
14. Lê Xuân Thám, 1998. Nấm Linh chi cây thuốc quý. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
15. Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền và Nguyễn Ánh Tuyết, 2003. Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TPHCM.
16. Nguyễn Đức Lượng, 2003. Vi sinh học cơng nghiệp, tập 2. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia TP.HCM
17. Nguyễn Lân Dũng, 2001. Cơng nghệ nuơi trồng nấm, tập 1 và 2. Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội.
18. Nguyễn Hữu Đống, 2003. Nuơi trồng chế biến nấm ăn và nấm làm thuốc chữa bệnh. Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội.
19. Nguyễn Hữu Đống và Đinh Xuân Linh, 2000. Nấm ăn nấm dược liệu - cơng dụng và cơng nghệ nuơi trồng. Nhà xuất bản Hà Nội.
20. Nguyễn Hữu Đống, Nguyễn Thị Sơn và Zani Federico, 2002. Cơ sở khoa học vàcơng nghệ nuơi trồng. Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội.
21. Nguyễn Lê Quốc Hùng, 2011. Khảo sát sự đa dạng của nấm Linh chi . Luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ ngành Sinh Thực nghiệm trường Đại học Đà Lạt.
22. Nguyễn Minh Khang, 2005. Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen