2.3.1. Nấm Linh chi
Nấm Linh chi đỏ Đà Lạt được Lê Xuân Thám phát hiện và sưu tầm năm 1989 ngay tại thành phố Đà lạt, chủng nấm này đã được tiến hành so sánh và giám định mẫu tại Trung tâm Nấm, Đại học Quốc gia Hà Nội. Kết quả cho thấy đây là chủng
C y chuy n t m m sang mơi trấ ề ơ ấ ường nhân gi ng c p 2ố ấ
Phân l p và kh o sát h s i n m Linh chi ậ ả ệ ợ ấ
trên mơi trường nhân gi ng c p 1ố ấ
Kh oả sát sự sinh trưởng c aủ s iợ nấm Linh chi trên mơi trường nhân giống c pấ 2
ánh giá nh h ng c a c ch t n sinh
Đ ả ưở ủ ơ ấ đế
trưởng và phát tri n c a n m Linh chi ể ủ ấ
C y meo gi ng t mơi trấ ố ừ ường nhân gi ng c p ố ấ
Ganderma lucidum địa phương, phân bố ở vùng cao nguyên Lâm Đồng đã phân lập, thuần khiết và nuơi trồng hồn chỉnh tại phịng Sinh học Phĩng xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân (Lê Xuân Thám, 1998).
2.3.2. Thiết bị
Que cấy, đèn cồn Cân phân tích 3 số lẻ Bình bơm tưới nước Điã petri
Tủ cấy vơ trùng Essco Nồi hấp Autoclave Tommy Tủ sấy
Túi nylon chui nhiệt, bơng nút , cổ nút
2.3.3. Mơi trường sử dụng
2.3.3.1. Mơi trường nhân giống cấp 1 (Lê Duy Thắng, 2009)
- Mơi trường PGA (Potato glucose agar) : Khoai tây: 200 (g)
Glucose: 20 (g)
Agar: 20 (g)
Nước cất vừa đủ: 1000 ml - Mơi trường PGA cải tiến : Khoai tây: 200 (g)
Glucose: 15 (g) Cao nấm men 1(g) KH2PO4 0,5(g) MgSO4 0,5(g) Pepton 1(g) Cà rốt 100(g)
Giá đỗ 100(g)
Agar: 20 (g)
Nước cất vừa đủ: 1000 ml - Mơi trường Mizuno
Pepton: 10 (g) Glucose: 25 (g) Maltose: 50 (g) NaCl: 5 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)
- Mơi trường Czapek – Dox
Saccharose: 30 (g) NaNO3: 3 (g) KH2PO4: 1 (g) MgSO4: 0,5 (g) KCl: 0,5 (g) FeSO4: 0,01 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml)
2.3.3.2. Mơi trường nhân giống cấp 2:
Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đĩ phối trộn dinh dưỡng theo các nghiệm thức thí nghiệm.
2.3.3.3. Mơi trường cơ chất mùn cưa cao su:
Mùn cưa cần phải rây để loại bỏ dăm bào, sau đĩ ủ với nước vơi 0,25% qua đêm và tiến hành phối trộn dinh dưỡng theo các nghiệm thức thí nghiệm.
2.4. Phương pháp thí nghiệm
2.4.1. Khảo sát sinh trưởng hệ sợi nấm Linh chi trên các mơi trường nhân giống cấp 1cấp 1cấp 1 cấp 1
2.4.1.1. Bố trí thí nghiệm
Theo T. Mizuno (1998), mơi trường nhân giống cấp 1 thường là mơi trường cĩ chứa Maltose. Để xác định mơi trường thích hợp nhất cho việc bảo quản và nhân giống cấp 1 phù hợp với phịng thí nghiệm và chuẩn bị cho quá trình phát triển nuơi trồng sản xuất, tiến hành khảo sát tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm trên các loại mơi trường: PGA, PGA cải tiến , mơi trường Mizuno, mơi trường Czapek – Dox.
Thí nghiệm một yếu tố được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, gồm 4 nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi gồm 5 đĩa pertri.
NT4 NT1 NT1
NT3 NT3 NT2
NT1 NT4 NT3
NT4 NT2 NT2
Hình 2.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi trên mơi trường
nhân giống cấp 1
Nghiệm thức Mơi trường nuơi cấy
NT1 PGA cải tiến
NT2 Czapek – Dox
NT3 Mizuno
NT4 PGA ( Đối chứng)
Tổng số ơ cơ sở: 4 x 3= 12 ơ
Tổng số điã cấy: 12 x 5=60 đĩa pertri
2.4.1.2. Cách tiến hành thí nghiệm:
trong vịng 25- 30 phút lọc lấy nước cho thêm 20g đường gluco, 20g agar cho vào nồi đun để hịa tan hết agar, bổ sung thêm nước cất định mức 1000ml.
Chuẩn bị mơi trường PGA cải tiến : 200g khoai tây gọt vỏ, 100g cà rốt, 100g giá đỗ rửa sạch cắt nhỏ đun sơi trong vịng 25- 30 phút lọc lấy nước cho thêm 15g đường gluco, 1g pepton, 1g cao nấm men, 0,5g KH2PO4, 0,5g MgSO4, agar 20g cho vào nồi đun để hịa tan hết agar, bổ sung thêm nước cất định mức 1000ml.
Với quả thể nấm tươi, tiến hành rửa vài lần bằng nước sạch và vơ trùng bề mặt nấm linh chi bằng cồn. Dùng dao tách gọt phần mơ bên ngồi để lộ ra lớp mơ vơ trùng bên trong, sẵn sàng cho tách giống, cĩ thể cắt thành những mảnh nhỏ 4- 10mm2. Cấy các mảnh mơ vừa tách lên mơi trường đĩa pertri, ủ trong tối khoảng 25oC.
2.4.1.3. Các chỉ tiêu theo dõi
- Đo tốc độ lan tơ nấm (cm/ ngày): dùng thước đo đường kính của khuẩn lạc. - Theo dõi định kỳ 2 ngày/ lần.
- Theo dõi cho đến khi hệ sợi nấm lan kín điã pertri.
2.4.2. Khảo sát sự sinh trưởng của sợi nấm trên mơi trường nhân giống cấp 22.4.2.1. Bố trí thí nghiệm2.4.2.1. Bố trí thí nghiệm2.4.2.1. Bố trí thí nghiệm 2.4.2.1. Bố trí thí nghiệm
Nguyên liệu dùng là hạt lúa nấu chín và mạt cưa cao su bổ sung các thành phần: cám gạo, cám bắp theo tỷ lệ của các nghiệm thức thí nghiệm.
Thí nghiệm một yếu tố được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, gồm 10 nghiệm thức 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 5 lọ thủy tinh.
Tổng số ơ cơ sở: 10x 3= 30 ơ.
Tổng số lọ thủy tinh: 30x 5=150 lọ thủy tinh.
NT10 NT5 NT4
NT6 NT8 NT6
NT1 NT5 NT1
NT7 NT4 NT8 NT3 NT7 NT4 NT8 NT6 NT9 NT5 NT9 NT10 NT9 NT3 NT2 NT10 NT1 NT7
Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm khảo sát sự sinh trưởng của sợi nấm trên mơi trường nhân
giống cấp 2
Nghiệm thức Mơi trường nuơi cấy
NT1 Lúa 90% + mùn cưa cao su 5% + cám gạo 5% NT2 Lúa 90% + cám bắp 5% + cám gạo 5%
NT3 Lúa 90% + cám gạo 10 %
NT4 Lúa 75% + mùn cưa cao su 25% + cám gạo 5%
NT5 Lúa 75% + mùn cưa cao su 15% + cám bắp 5%+ cám gạo 5% NT6 Lúa 75% + cám bắp 15% + cám gạo 10%
NT7 Lúa 50% + mùn cưa cao su 40% + cám bắp 5% + cám gạo 5% NT8 Lúa 50% + mùn cưa cao su 35%+ cám bắp 5% + cám gạo 10% NT9 Lúa 50% + mùn cưa cao su 50%
NT10 Luá 100% (Đ/C)
2.4.2.2. Cách tiến hành thí nghiệm:
Tiến hành phối trộn mơi trường theo các nghiệm thức thí nghiệm sao cho độ ẩm đạt khoảng 60%, cho mơi trường vào chai thủy tinh khối lượng 100g/ chai thủy tinh, khử trùng 121oC/ 60 phút, để nguội và cấy giống vào ở độ tuổi 10 – 12 ngày.
Tiến hành cấy meo giống trong tủ cấy vơ trùng: sau khi khử trùng tủ cấy dùng dao hoặc que cấy cắt một mảnh thạch cĩ chứa tơ nấm trên điã pertri cấy chuyền vào lọ thủy tinh cĩ chứa lúa đã nấu nứt nanh phối trộn theo các nghiệm thức.
2.4.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi:
- Quan sát độ lan sâu của sợi nấm cho đến khi sợi nấm lan kín cả lọ thuỷ tinh.
2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng cuả cơ chất đến sinh trưởng, phát triển và năng suất của nấm Linh chi tại Bảo Lộc, Lâm Đồng.của nấm Linh chi tại Bảo Lộc, Lâm Đồng.của nấm Linh chi tại Bảo Lộc, Lâm Đồng. của nấm Linh chi tại Bảo Lộc, Lâm Đồng.
2.4.3.1. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm một yếu tố được bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên Trong thí nghiệm gồm 9 nghiệm thức với 3 lần lặp lại, mỗi nghiệm thức gồm 30 bịch nấm chọn ngẫu nhiên 10 bịch trong mỗi nghiệm thức để theo dõi chỉ tiêu.
Tổng số ơ cơ sở: 9x 3= 27 ơ
Tổng số bịch cơ chất : 30x 27= 810 bịch cơ chất
Nghiệm thức Mơi trường cơ chất mùn cưa Cao su
NT1 Mùn cưa 75% + cám gạo 25% bổ sung thêm urê 0,25% (Trần Văn Mão, 2004)
NT2 Mùn cưa 95% + cám gạo 5% bổ sung (urê 0,25% + DAP 0,25%) NT3 Mùn cưa 100% bổ sung (SA 0,5% + DAP 0,25%)
NT4 Mùn cưa 96% + 2% cám bắp + 2% cám gạo (Erkel, 2009) NT5 Mùn cưa 90% + cám bắp 10% (Saleh Ahmed, 2009)
NT6 Mùn cưa 75% + cám bắp 10% + cám gạo 15% (Lê Xuân Thám, 1998) NT7 Mùn cưa 95% + cám gạo 5% bổ sung (DAP 0,2% +SA 0,2%+urê 0,1%) (Nguyễn Minh Khang, 2005)
NT8 Mùn cưa 70% + cám gạo 30% (Saleh Ahmed, 2009) NT9 Nơng dân (mùn cưa 90% + cám bắp 5% + 5% cám gạo )
NT1 NT5 NT4
NT9 NT3 NT6
NT5 NT6 NT3
NT7 NT4 NT6
NT4 NT8 NT9
NT3 NT1 NT5
NT8 NT7 NT8
NT1 NT2 NT9
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng cuả cơ chất đến sinh trưởng,
phát triển và năng suất của nấm Linh chi tại Bảo Lộc, Lâm Đồng
2.4.3.2. Cách tiến hành:
Mùn cưa cao su khơ được bổ sung vơi bột với tỷ lệ 0,2% (theo trọng luợng khơ của mùn cưa), bổ sung nước, trộn đều và ủ qua đêm. Độ ẩm của cơ chất mùn cưa đã ủ vơi qua đêm khoảng 45%.
Trộn đều các loại cơ chất tổng hợp trên với nước sạch (cĩ bổ sung các chất dinh dưỡng) để đạt đến độ ẩm 65 - 70% và đĩng vào các bịch PP cĩ kích thước 22,5cm x 30 cm, mỗi bịch cơ chất cĩ trọng lượng 1 kg. Sau đĩ ta đưa các túi này vào nồi hấp khử trùng ở 1 atm, nhiệt độ 1210C trong 1,5 h.
Sau khi giá thể nguội, tiến hành cấy giống từ mơi trường hạt sang mơi trường mùn cưa trong tủ cấy vơ trùng, tiến hành dưới ngọn lửa đèn cồn. Độ tuổi thích hợp nhất của meo giống là 20 ngày. Mỗi bịch cơ chất cấy 10 - 15 g meo giống. Lượng giống cho vào vừa đủ.
Sau khi cấy meo nấm các bịch cơ chất được ủ tơ trong phịng thí nghiệm ở nhiệt độ 25- 28 0C thích hợp để tơ nấm phát triển.
Khi tơ nấm sẽ phủ trắng hết bịch cơ chất, chuyển bịch cơ chất sang phịng nuơi trồng nấm. Giai đoạn hình thành quả thể giữ độ ẩm trong phịng nuơi trồng nấm từ 85-90%, nhiệt độ 30- 320C. Phun sương trực tiếp vào bịch nấm, phun 1-2 lần/ ngày.
2.4.3.3. Các chỉ tiêu theo dõi
Chỉ tiêu về sinh trưởng:
bắt đầu cấy meo vào bịch phơi cho đến khi tơ nấm ăn trắng cả bịch phơi. Đo từ cổ túi đến sợi tơ dài nhất, theo dõi 5 ngày/ lần.
- Thời gian tăng trưởng tơ nấm (ngày): theo dõi thời gian bắt đầu mọc tơ nấm, thời gian tơ nấm phủ 1/3 bịch, thời gian tơ nấm phủ 1/2 bịch, thời gian tơ nấm phủ kín bịch cơ chất.
- Tốc độ tăng trưởng của sợi tơ (cm/ngày): theo dõi chiều dài tơ nấm từ lúc bắt đầu cấy meo vào bịch phơi cho đến khi tơ nấm ăn trắng cả bịch phơi và tính trung bình cho một ngày.
- Thời gian tơ ăn đầy bịch nấm (ngày): tính từ lúc cấy meo giống cho đến khi các bịch đo chỉ tiêu tơ ăn trắng đầy bịch.
- Thời gian ra quả thể từ lúc rút bơng cho đến khi cĩ 10 bịch ra quả thể đầu tiên.
- Số chùm quả thể / bịch : đếm tất cả số chùm quả thể trên các bịch theo dõi, lấy trung bình cho một bịch.
- Chiều dài cuống nấm: dùng thước đo từ gốc cuống nấm đến phần cuống nấm tiếp giáp với mũ nấm.
- Độ dày mũ nấm: cắt theo chiều dọc từ mặt trên xuống mặt dưới của mũ nấm ở vị trí qua cuống nấm và dùng thước đo.
- Chiều dài mũ nấm (cm): đo chiều dài mũ nấm bằng thước kẻ. Chỉ tiêu về năng suất:
- Năng suất nấm tươi = trọng lượng trung bình nấm tươi / 1 bịch cơ chất khi thu hoạch.
- Năng suất nấm khơ = trọng lượng trung bình nấm khơ/1 bịch cơ chất khi thu hoạch.
- Hiệu suất sinh học = trọng lượng nấm khơ/ trọng lương cơ chất khơ * 100%
3.5. Xác định dược chất cĩ trong nấm Linh chi đỏ Đà Lạt (Ganoderma licidum)3.5.1. Phương pháp định tính alcaloid (Trần Hùng, 2004)3.5.1. Phương pháp định tính alcaloid (Trần Hùng, 2004)3.5.1. Phương pháp định tính alcaloid (Trần Hùng, 2004) 3.5.1. Phương pháp định tính alcaloid (Trần Hùng, 2004)
3.5.1.1. Chuẩn bị dịch thử
Để phát hiện sự hiện diện của alcaloid trong dược liệu người ta thường áp dụng nguyên tắc thử của Webb với cách thử gồm 2 phần như sau:
- Phần 1: Bột nấm Linh Chi xay nhuyễn (10 – 20 gam) và dung dịch nước 1% H2SO4 được cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với cả 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
Quan sát kết tủa, nếu cĩ kết tủa theo qui định là dương tính. Tuy nhiên, nếu khơng cĩ kết tủa, chưa thể kết luận là khơng cĩ alcaloid mà phải tiếp tục thử nghiệm phần 2.
- Phần 2: Bột xay nhuyễn (10 – 20 gam) ngâm trong dung dịch prollius là hổn hợp gồm: chloroform:ethanol 95o:NH4OH đậm đặc, theo tỷ lệ là 8:8:1 (mơi trường phải cĩ tính baz). Ngâm nguội trong 24 giờ, ở nhiệt độ phịng, thỉnh thoảng lắc trộn. Lọc và đuổi dung mơi đến cạn, thu được cặn. Hịa tan cặn trong dung dịch HCl 1% đun ấm cho dễ tan. Lọc và lấy dịch lọc để thử nghiệm với 2 loại thuốc thử: Mayer, Dragendorff.
3.5.1.2. Thuốc thử định tính alcaloid
Thuốc thử Mayer: Hịa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid lỗng cĩ chứa alcaloid, nếu cĩ alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành cĩ thể hịa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hịa tan bởi ethanol cĩ sẵn trong dung dịch thử.
- Thuốc thử Dragendorff: Hịa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml HNO3 30% (D=1,18). Hịa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất.
Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5oC sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, cất trong tủ lạnh, cĩ thể giữ lâu vài tuần.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid lỗng cĩ chứa alcaloid, nếu cĩ alcaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.
3.5.2. Phương pháp xác định hợp chất saponin (Trần Hùng, 2004)
Chiết 10 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cơ dịch lọc bốc hơi đến cắn khơ. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính.
3.5.2.1. Thử nghiệm tính tạo bọt
Một đặc tính quan trọng của saponin là tính tạo bọt, nên đây là một trong những phương pháp chính xác để định tính sự hiện diện của saponin.
Cách tiến hành: Hịa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu vào 5 ml nước nĩng. Lọc vào một ống nghiệm 1,6 – 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dùng ngĩn tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:
Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++
3.5.2.2. Thử nghiệm Fontan – Kaudel
Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nĩng nhẹ trên cách thủy để hịa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13)
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bĩng trong cả 2 ống nghiệm.
định là cĩ saponin triterpenoid.
- Nếu ống pH = 13 cĩ cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH =1, sơ bộ xác định là cĩ saponin steroid.
3.5.3. Định tính triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard)
Chiết 10 – 20 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nĩn, trong 10– 20 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi khơng cịn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cơ lại đến khi cịn khoảng 50 ml dịch chiết ether.
Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hơi tới cắn. Hịa tan cắn với 0,5 ml anhydrid acetic, rồi thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform. Chuyển dung dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khơ, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận 1 – 2 ml H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch cĩ màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần