quan trọng
Từ các chƣơng trình giải mã cDNA/ EST ở tôm sú (P. monodon) đã xác định đƣợc trình tự một số gen liên quan tới miễn dịch, sinh trƣởng, và sinh sản [40, 84, 85, 89, 103]. Những gen này đã và đang đƣợc tiếp tục nghiên cứu nhằm chứng minh chức năng và vai trò của chúng trong cơ thể [18, 82, 88, 92]. Tuy nhiên, các gen mã hóa các protein vẫn chƣa đƣợc phân tích nhiều và số lƣợng những gen này còn khá ít ỏi so với số lƣợng các dòng EST thu đƣợc.
Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về đặc điểm sinh trƣởng, sinh sản và hệ thống miễn dịch của tôm sú còn rất hạn chế do thiếu nhiều những thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng. Do vậy, tiếp cận nghiên cứu cấu trúc của một số gen liên quan đến sinh trƣởng, sinh sản, và miễn dịch sẽ là những nguyên liệu quan trọng phục vụ cho những nghiên cứu chức năng sâu hơn. Dƣới đây là một vài ví dụ cụ thể về một số gen liên quan tới các tính trạng quan trọng:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Syntenin
Syntenin của tôm sú là một trong những protein đƣợc quan tâm nghiên cứu. Đây là một loại protein trung gian trong quá trình dẫn truyền tín hiệu nội bào.
Syntenin tƣơng tác với domain hƣớng tế bào chất (cytoplasmic domain) của một loại protein xuyên màng syndecan [39]. Năm 2002, một đoạn gen syntenin đã đƣợc phân lập từ thƣ viện cDNA mô máu của tôm sú nhiễm virus gây bệnh đốm trắng [20]. Đoạn gen syntenin đã phân lập này có chiều dài 719 bp (mã số GenBank AF335106), trình tự protein suy diễn 233 amino acid với mã kết thúc TAA. Brangrak và đồng tác giả (2002) đã chứng minh syntenin biểu hiện mạnh khi tôm bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Phân tích so sánh trình tự protein cho thấy, syntenin chứa hai PDZ (postsynaptic density protein) domain. PDZ domain là vị trí diễn ra các phản ứng tƣơng tác giữa syntein với các protein khác [34]. Để nghiên cứu sâu hơn mối liên kết giữa syntenin và sự xâm nhiễm virus ở tôm sú, ngƣời ta đã tiến hành các thí nghiệm nhằm xác định các protein tƣơng tác trực tiếp với syntenin [93]. Ở nghiên cứu này trình tự đầy đủ của syntenin (kích thƣớc là 969bp) đã đƣợc phân lập và biểu hiện. Tuy nhiên, trình tự này không đƣợc đăng ký trên GenBank. Kết quả nghiên cứu của Tonganunt và cộng sự cho thấy syntenin tƣơng tác với alpha-2-macroglobulin ( 2M), một loại protein có trong huyết tƣơng. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy 2M có vai trò ức chế hoạt động của proteinase và là protein quan trọng trong hệ thống miễn dịch của tôm [10]. Cả syntenin và 2M cùng đƣợc điều khiển tăng biểu hiện khi tôm nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Ngoài ra, nghiên cứu gần đây cho thấy syntenin còn tƣơng tác với nhân tố khởi đầu dịch mã eIF5A và cân bằng sự điều khiển tín hiệu của eIF5A tới p53 cần thiết cho quá trình apoptosis [53].
Hemocyanin
Đầu tiên hemocyanin đƣợc biết đến là một protein vận chuyển oxy phân tử. Sau đó, nó đƣợc chứng minh là một loại protein đa chức năng liên quan đến các phản ứng miễn dịch và các quá trình sinh lý nhƣ dự trữ protein, điều khiển thẩm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
thấu, chu kỳ lột xác và sự hóa cứng lớp vỏ cu-tin [104]. Gần đây, hemocyanin và một số peptide có trình tự tƣơng đồng với trình tự amino acid đầu C của hemocyanin (95-100%) đã đƣợc chứng minh có chức năng kháng khuẩn và kháng nấm [109, 110, 123]. Nghiên cứu về hemocyanin ở loài tôm Penaeus japonicus đã phát hiện hai gen mã hóa hai tiểu phần (subunit) của phức hợp phân tử hemocyanin là PjHcL và PjHcY. Hai gen PjHcL và PjHcY có sự biểu hiện khác nhau ở mức độ phiên mã khi tôm nhiễm WSSV, cụ thể là gen PjHcL có biểu hiện mạnh hơn [119]. Năm 2006, Zhang và cộng sự chỉ ra hemocyanin của Litopenaeus vannamei có thể kết hợp trực tiếp với 8 loài nguồn bệnh vi khuẩn ở tôm [136]. Hemocyanin đƣợc tách chiết ở tôm sú và cho thấy khả năng kháng nhiều loại virus bao gồm cả virus RNA và DNA [135]. Tuy nhiên cơ chế kháng virus của hemocyanin vẫn chƣa đƣợc sáng tỏ.
Ran protein
Ran là một thành viên của siêu họ Ras (Ras superfamily) có bản chất là GTPase kích thƣớc nhỏ. Protein này có mức độ bảo thủ cao ở sinh vật nhân chuẩn từ nấm men đến con ngƣời [115]. Ran GTPase là chìa khóa điều khiển sự vận chuyển chất giữa nhân và tế bào chất trong suốt kỳ trung gian của quá trình phân bào. Hầu hết sự vận chuyển này đƣợc điều khiển bởi chu kỳ của Ran giữa trạng thái Ran-GTP và Ran-GDP [124]. Hơn nữa, nghiên cứu gần đây cho thấy Ran GTPase còn liên quan đến cơ chế bảo vệ của tôm đối với virus WSSV [114].
Nghiên cứu gen Ran ở tôm Penaeus japonicus cho thấy, gen này có chiều dài 645 bp và không có intron khi so sánh với genomic DNA. Ran protein của P. japonicus đƣợc kiểm tra hoạt tính bám GTP và tiếp tục phân tích chức năng. Kết quả RT-PCR và Western blot đã chỉ ra rằng các bản phiên mã và protein Ran đƣợc phát hiện ở các mô bao gồm: gan tụy, huyết thanh, mang, ruột, tim và cơ. Ở tôm nhiễm WSSV và kháng WSSV sau khi nhiễm 4h, gen Ran đƣợc điều khiển tăng đáng kể, điều đó chứng tỏ nó đóng vai trò trong miễn dịch của tôm chống lại sự lây
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhiễm virus [114]. Trong nghiên cứu gần đây, Ran GTPase của P. japonicus liên kết với chuỗi nhẹ của myosin, tham gia vào cơ chế thực bào [126]. Ran GTAase mới bắt đầu đƣợc chú ý nghiên cứu ở tôm P. japonicus.
Rho protein
Rho cũng là một thành viên thuộc siêu họ Ras (Ras superfamily). Hầu hết các nghiên cứu của các Ras protein về hoạt tính miễn dịch tập trung vào sự điều khiển cơ chế thực bào bởi Rho GTPase [107] và các nhân tố chịu tác động của Rho ảnh hƣởng đến sự điều chỉnh vận động của actin trong quá trình thực bào ở động vật có vú [106]. Ở tôm P. japonicus, nghiên cứu so sánh sự biểu hiện gen giữa tôm kháng virus WSSV với tôm thƣờng cho thấy: các gen Ranbp, Rho và Rab đƣợc điều khiển tăng đáng kể trong biểu hiện ở tôm kháng virus. Đây là bằng chứng chứng tỏ những GTPase này tham gia vào quá trình truyền tín hiệu trong phản ứng bảo vệ ở tôm [125]. Ngoài ra, khi xây dựng thƣ viện EST tôm sú Tassanakajon và cộng sự đã chỉ ra: khi tôm sú ở trong điều kiện nhiệt độ bắt buộc (heat stress), gen Rho ở mô
máu của tôm sú đƣợc biểu hiện tăng [87].
b. Các gen liên quan tới sinh sản Vitellogenin
Vitellogenin (Vg) của tôm sú có kích thƣớc cDNA khoảng 6,8 kb; mã hóa cho 1943 amino acid với khối lƣợng phân tử là 211 kDa. Protein Vg bao gồm các domain giàu systein có mức độ bảo thủ cao. Vg là tiền thân của hầu hết các protein trong lòng đỏ trứng, là nguồn dinh dƣỡng trong thời kỳ đầu phát triển phôi thai và ấu trùng và hiện đang là marker sinh học trong xác định giới [131]. Các quá trình của sinh học của Vg đƣợc điều khiển bởi các hormone nội tiết bao gồm: Crustacean hyperglycemic hormone (CHH), molt-inhibiting hormone (MIH), và gonad-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
inhibiting hormone (GIH). mRNA thông tin của gen Vg có cả trong mô gan tụy và mô buồng trứng tuy nhiên sự biểu hiện của Vg trong hai mô này trong các giai đoạn phát triển là khác nhau. Trong mô buồng trứng gen Vg biểu hiện mạnh trong giai đoạn đầu tổng hợp lòng đỏ trứng và giảm dần trong các giai đoạn sau. Sự biểu hiện của gen Vg ảnh hƣởng trực tiếp tới sự phát triển của buồng trứng chính vì vậy nó có liên quan rất lớn tới sự sinh sản của tôm [89].
PmSePM
Trình tự cDNA đầy đủ của selenoprotein M precursor (PmSeP) của tôm sú có kích thƣớc 904 bp với khung đọc mở (ORF) 396 bp và mã hóa cho chuỗi peptide gồm 131 amino acid. Năm 2010 Rachanimuk và cộng sự đã nghiên cứu phân lập và mô tả các gen chức có liên quan tới sự phát triển buồng trứng của tôm sú giant tiger shrimp Penaeus monodon thông qua phƣơng pháp nghiên cứu biểu hiện các gen có chọn lọc suppression subtractive hybridization (SSH). Kết quả của của RT-PCR của nhóm tác giả này cho thấy rằng mức độ biểu hiện của PmSePM đã giảm đáng kể khi mô buồng trứng của tôm sú phát triển. Theo đó, sự biểu hiện của PmSePM có thể sử dụng nhƣ marker sinh học để đánh giá mức độ sinh sản của tôm sú trong các giai đoạn trƣởng thành [74].
c. Các gen liên quan tới sinh trưởng và sinh sản
Ở côn trùng, sự lột xác không còn xuất hiện ở giai đoạn trƣởng thành. Tuy nhiên, ở động vật giáp xác, quá trình lột vỏ diễn ra trong suốt quá trình trƣởng thành và sinh sản. Quá trình lột xác và sinh sản trong động vật giáp xác là quá trình phối hợp, cả hai đều chịu sự kiểm soát của các hormone nội tiết: Crustacean hyperglycemic hormone (CHH), molt-inhibiting hormone (MIH), và gonad- inhibiting hormone (GIH) đƣợc tiết ra từ các xoang nằm dƣới gốc mắt (eyetalk). Bên cạnh đó các tế bào thần kinh gốc mắt (eyestalk neuropeptides), các hormone
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
sinh dục (steroid), và juvenoid cũng tham gia vào quá trình điều hòa sự lột xác và sinh sản .
CHH
CHH là một hormone quan trọng có liên quan đến sự sinh trƣởng và nhiều quá trình sinh lý trong vòng đời của tôm, CHH liên quan đến quá trình chuyển hóa carbonhydrate, gây tăng đƣờng huyết và tăng lipid máu trong hemolymph, để cung cấp glucose và chất béo, đáp ứng nhu cầu năng lƣợng của các mô cơ quan. Ngoài ra CHH còn có vai trò trong việc ức chế sự lột vỏ của tôm. CHH cũng đƣợc chứng minh là có vai trò trong việc kích hoạt sự khởi đầu của quá trình vitellogenesis (giai đoạn cuối cùng của sự chín sinh dục để trở thành trứng trƣởng thành) và kích thích sự phát triển của buồng trứng. Gen CHH tồn tại ở ít nhất là 6 bản sao có kích thƣớc từ 1,5 kb đến 2,1 kb bao gồm 3 vùng exon và 2 vùng intron (1 vùng mã hóa cho vùng peptide tín hiệu) [89].
GIH
GIH là hormone có vai trò ức chế tuyến sinh dục, trình tự cDNA của gen GIH ở tôm có kích thƣớc 861 bp gồm khung đọc mở ORF 288 bp mã hóa cho 79 amino acid đƣợc ký hiệu là Pem-GIH. Sự ức chế của GIH đối với tuyến sinh dục là khá rõ ràng, tuy nhiên, cơ chế kiểm soát của GIH trong quá trình vitellogenesis vẫn chƣa đƣợc sáng tỏ [89].
MIH
MIH là hormone đóng vai trò quan trọng trong điều hòa quá trình lột xác của tôm. MIH có kích thƣớc cDNA là 697 bp chứa khung đọc mở 312 bp , 81 bp 5‟ UTR 302 3‟ UTR mã hóa cho chuỗi peptide gồm 103 amino acid với khối lƣợng khoảng 11 kDa trong đó 28 amino acid là vùng peptide tín hiệu và 75 amino acid là chuỗi peptide trƣởng thành. Từ năm 1994, trình tự mã hóa của MIH đã đƣợc dòng hóa trên loài tôm thẻ chân trắng thông qua kỹ thuật 3‟ 5‟ RACE. MIH là protein
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nhiều chức năng, gen NIH đƣợc xem là chỉ thị để phát hiện sự đa dạng liên quan tới các tính trạng [103].