Bƣớc tiếp theo trong việc kiểm tra thƣ viện mới tạo lập đó chính là kiểm tra kích thƣớc các đoạn chèn. Trên vector có chứa trình tự cắt của enzyme giới hạn
BsrGI (Hình 2.6), đây là enzyme có tần số lặp lại rất thấp cho nên có thể sử dụng để kiểm tra các đoạn chèn bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn này.
Vector pDONR222 đối chứng (chƣa thực hiện phản ứng BP) sẽ có 3 vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BsrGI nhƣ trên bản đồ Hình 2.6, khi tiến hành phản ứng cắt sẽ cho ra 3 băng có kích thƣớc lần lƣợt 2,5 kb; 1,4 kb và 790 bp. Đối với mẫu đã xảy ra phản ứng tái tổ hợp giữa vector pDONR222 với đoạn cDNA mới tạo, khi tiến hành phản ứng cắt với enzyme giới hạn BsrGI sẽ cho ra một băng 2,5 kb
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
(vector backbone) và một hoặc nhiều băng có kích thƣớc không trùng lặp với đối chứng.
Sản phẩm cắt sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Hình 3.5 là hình ảnh minh họa một số kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp
a
b
Hình 3. 5. Điện di đồ kiểm tra kích thƣớc cDNA đã đƣợc đƣa vào vector pDONR222
a,b: minh họa vector tái tổ hợp thuộc các thư viện cDNA/EST;
M: Marker 1kb; 1-11(a): các mẫu mô cơ; 12(a)-16(a),1(b)-5(b): các mẫu mô gan tụy; 6(b)-16(b): các mẫu mô cuống mắt
Tƣơng tự nhƣ các mẫu phân tích ở Hình 3.5, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra 1630 plasmid tái tổ hợp tách chiết từ các dòng tế bào của từ tất cả các thƣ viện cDNA/EST của tôm sú đã tạo lập. Kết quả điện di kiểm tra cho thấy, mặc dù vẫn còn tồn tại một số các vector không tái tổ hợp, tuy nhiên một số lƣợng lớn các đoạn chèn có kích thƣớc khác nhau xuất hiện nhƣ trên hình đã chứng tỏ kết quả tái tổ hợp, các plasmid tái tổ hợp đủ điều kiện để thực hiện các phân tích tiếp theo.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/