các vị trí tái tổ hợp đặc hiệu
2.2.3.1. Tổng hợp cDNA có chứa trình tự attB1 và attB2 (DNA recombination sites) ở hai đầu
Nguyên lý
Tổng hợp cDNA đƣợc tiến hành bằng cách sử dụng bộ kit “CloneMiner™ cDNA Library Contruction Kit” (Invitrogen). Nguyên lý của quá trình tổng hợp cDNA đƣợc thể hiện ở Hình 2.4.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thực hiện
* Tổng hợp sợi cDNA thứ nhất
Sợi mRNA đƣợc sử dụng làm khuôn và mồi Biotin-aatB2-Oligo(dT) để tổng hợp sợi cDNA thứ nhất. Trƣớc hết, thực hiện phản ứng gắn mồi với thành phần phản nhƣ sau:
mRNA + H2O: 10 µl
Biotin-aatB2-Oligo (dT): 1 µl
10 mM dNTPs: 1 µl
Tổng thể tích: 12 µl
Trộn đều thành phần phản ứng sau đó ly tâm nhẹ để toàn bộ dung dịch bám trên thành ống rời xuống đáy ống, tiếp đến đem ủ thành phần phản ứng ở 65oC trong 5 phút sau đó chuyển sang 45o
C trong 2 phút. Trong thời gian để phản ứng thứ nhất thực hiện ta tiếp tục chuẩn bị cho phản ứng thứ 2. Thành phần phản ứng thứ 2 nhƣ sau:
5X First Strand Buffer: 4 µl
0,1M DDT: 2 µl
H2O: 1 µl
Tổng thể tích: 7 µl
Trộn đều thành phần phản ứng sau đó ly tâm nhẹ để toàn bộ dung dịch tập trung ở phần đáy ống. Sau khi phản ứng thứ 1 kết thúc 2 phút ở 45o
C ta chuyển toàn bộ thành phần của phản ứng thứ 2 sang ống phản ứng thứ nhất, tiếp tục trộn đều và ly tâm nhẹ sau đó tiếp tục ủ ở 45oC trong 2 phút. Sau khi kết thúc 2 phút ủ ở 45oC tiếp tục giữ ống phản ứng ở 45oC rồi cẩn thận bổ sung 1 µl enzyme Reverse Transcriptase, trộn đều bằng pipet rồi tiếp tục ủ ở 45oC trong 60 phút.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kết thúc phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất, mRNA đƣợc loại bỏ nhờ enzyme RNase-H, tiếp đó sợi cDNA thứ hai đƣợc tổng hợp dựa trên khuôn là sợi cDNA thứ nhất. Thành phần phản ứng nhƣ sau:
Sản phẩm phản ứng tổng hợp sợi cDNA thứ nhất: 20 µl
H2O: 92 µl
5X Second Strand buffer: 30 µl
10 mM dNTPs: 3 µl
E.coli DNA Ligase: 1 µl
E.coli DNA Polymerase: 4 µl
E.coli RNase H: 1 µl
Tổng thể tích: 151 µl
Trộn đều thành phần phản ứng sau đó ly tâm nhẹ rồi đem ủ phản ứng ở 16oC trong 2 giờ. Bổ sung 2 µl enzyme T4 DNA Polymerase để tạo đầu bằng cho sợi đôi cDNA, trộn đều sau đó ly tâm nhẹ rồi tiếp tục đem ủ ở 16oC trong 10 phút. Kết thúc 10 phút phản ứng tiếp tục bổ sung 10 µl EDTA pH 8,0 để dừng phản ứng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Để có thể thực hiện các phản ứng tiếp theo thì yêu cầu là cần phải loại bỏ các sản phẩm phụ trong phản ứng bằng cách bổ sung 160 µl dung dịch chứa Phenol: Chloroform: Isoamyl alcohol (25: 24: 1) tiếp đó lắc mạnh rồi chuyển ống phản ứng lên máy ly tâm, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC sau đó tiến hành thu dịch nổi rồi chuyển sang ống Epp 1,5 ml sạch. Chuẩn bị hỗn hợp bao gồm:
Glycogen: 1 µl
7.5 M NH4OAc: 80 µl
100% Ethanol: 600 µl
Tiếp tục bổ sung hỗn hợp kể trên vào ống phản ứng và đem ủ ở -80oC trong 15 phút. Sau 15 phút ủ chuyển ống sang máy ly tâm, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC tiếp theo là loại bỏ dịch và thu lấy tủa. Tiếp tục bổ sung 150 µl cồn 70% để loại bỏ các muối dƣ thừa sau đó chuyển ống sang máy ly tâm, ly tâm 12000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Tiếp theo tiến hành loại dịch nổi và thu lấy tủa. Tủa thu đƣợc đƣợc làm khô bằng máy speedvac trong khoảng 5 phút. Bƣớc cuối cùng đó là bổ sung 18 µl nƣớc đã khử ion để hòa tan lại tủa chính là sợi đôi cDNA.
* Gắn adapter aatB1 vào sợi cDNA
Sau khi tổng hợp và tạo đầu bằng cho sợi cDNA bƣớc tiếp theo đó là gắn đoạn attB1 vào để sợi cDNA thu đƣợc có khả năng tái tổ hợp với vector pDONR222. Thành phần phản ứng nhƣ sau: cDNA 18 µl 5X Adapter Buffer: 10 µl aatB1 Adapter: 10 µl 0,1M DDT: 7 µl T4 DNA Ligase: 5 µl Tổng thể tích: 50 µl
Trộn đều thành phần phản ứng rồi sau đó đem ủ ở 16oC trong 16 – 24 giờ để phản ứng có thể thực hiện.