các điểm attB và attP
Nguyên lý
Phản ứng gắn cDNA vào vector đƣợc tiếp tục thực hiện bằng cách sử dụng “CloneMiner cDNA Library Construction Kit” (Invitrogen). Đây là công nghệ dựa trên nguyên lý của hệ thống tái tổ hợp đặc hiệu vị trí (site-specific recombination system) của bacteriophage lambda khi chúng tích hợp vào chromosome của vi khuẩn E. coli, trong đó attB là các vị trí tái tổ hợp trên chromosome của vi khuẩn E. coli và attP là các vị trí tái tổ hợp trên phage. Quá trình tích hợp DNA của phage vào chromosome của vi khuẩn đƣợc thực hiện nhờ sự xúc tác của hai loại protein là Intergrase và Integration host factor.
Các đoạn cDNA đã tổng hợp đƣợc có đoạn trình tự attB1 và attB2 ở hai đầu. Sau đó, cDNA đƣợc đƣa vào vector pDONR222 (Hình 2.6) có chứa các vị trí tái tổ hợp tƣơng ứng attP1 và attP2. Hỗn hợp enzyme có tên thƣơng mại là BP Clonase sẽ xúc tác cho phản ứng gắn cDNA vào vector (BP reaction). Nguyên lý của quá trình này đƣợc thể hiện ở Hình 2.7:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2. 6. Bản đồ vector pDONR222
Hình 2. 7. Nguyên lý của quá trình đƣa cDNA vào vector pDONR222 (BP reaction)
Thực hiện:
- Sau khi đƣợc gắn adapter, các đoạn cDNA đƣợc đƣa vào vector pDONR222 thông qua phản ứng BP (BP reaction Hình 2.7) với các thành phần sau:
cDNA 9 µl
Vector pDONR222 (250ng/µl) 1 µl
5X BP Clonase Buffer 4 µl
BP Clonase Enzyme mix (-80oC) 6 µl
Tổng thể tích 20 µl
Trộn đều thành phần phản ứng sau đó ly tâm nhẹ, tiếp đến ủ hỗn hợp ở 25oC trong 16 – 20 giờ.
- Để dừng phản ứng tái tổ hợp BP, bổ sung 2 µl enzyme protease K vào hỗn hợp phản ứng rồi ủ ở 37oC trong 20 phút, sau đó bất hoạt enzyme ở 70o
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Vector tái tổ hợp đƣợc tinh sạch lại bằng cách bổ sung hỗn hợp sau:
H2O: 80 µl
Glycogen: 1 µl
7,5 M NH4OAc: 50 µl
100% Ethanol: 375 µl
- Ủ hỗn hợp ở -80oC trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 25 phút ở 4oC, sau đó loại bỏ dịch nổi và thu lấy tủa.
- Tiến hành rửa tủa thu đƣợc bằng việc bổ sung 150 µl Ethanol (cồn) 70% sau đó ly tâm tại 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC. Lặp lại bƣớc rửa tủa thêm 1 lần nữa. - Làm khô tủa cDNA thu đƣợc bằng máy SpeedVac trong khoảng 5 phút. Cuối cùng hòa tan lại tủa bằng 10 µl đệm TE hoặc H2O.