1.3.1. Chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh
Khi dịch bệnh bùng phát, ngƣời dân thƣờng sử dụng thuốc Doxicyline, Oxy Tetracycline để điều trị. Tuy nhiên, cách làm này không hữu hiệu vì bệnh có thể tái phát mạnh sau 2 tuần đến 1 tháng. Hiện tại chƣa có thuốc đặc hiệu để trị bệnh nên công tác phòng ngừa tổng hợp bao gồm tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản sự xâm nhập của các sinh vật mang mầm bệnh vào ao nuôi và sử dụng tôm giống sạch bệnh đƣợc khuyến cáo nhƣ một biện pháp an toàn sinh học [33]. Do đó cần có các phƣơng pháp phát hiện sớm sự hiện diện virus gây bệnh trên đàn tôm giống trƣớc khi thả nuôi và trên ao nuôi tôm công nghiệp nhằm hạn chế nguy cơ bùng phát dịch bệnh.
a. Các phương pháp chẩn đoán dựa trên DNA Phương pháp PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc biết đến nhƣ là một kỹ thuật có độ nhạy và độ chính xác cao đƣợc ứng dụng cho việc chẩn đoán tác nhân virus gây bệnh trên tôm. Việc chẩn đoán WSSV bằng kỹ thuật Nested PCR [27], YHV bằng RT-PCR [98], và IMNV, IHHNV với việc sử dụng kỹ thuật Nested RT-PCR [70, 73] là những phƣơng pháp chuẩn mà Cơ quan Quốc tế về Dịch bệnh Động vật (OIE) đã công nhận và đang đƣợc sử dụng tại các phòng thí nghiệm ở Mỹ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản... Ngoài ra, phƣơng pháp chẩn đoán đồng thời nhiều tác nhân gây bệnh hại bằng Multiplex RT-PCR cũng đã đƣợc phát triển và ứng dụng [11, 12, 71]. Một kỹ thuật khác, Realtime PCR, có khả năng định lƣợng số bản sao virus cũng đã đƣợc công bố [47, 75].
Mặc dù PCR đã là một trong những phƣơng pháp hiệu quả và phổ biến nhất trong phát hiện các bệnh của tôm, tuy nhiên cũng đã có những báo cáo về các kết quả dƣơng tính giả đã đƣợc báo cáo trong một số nghiên cứu của các nhà khoa học của Thái Lan [81] và Ấn độ [41]. Điều này cho thấy, các mồi nên đƣợc thiết kế chỉ trong vùng bảo thủ của virus.
Ngoài ra, phƣơng pháp Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) [69] là kỹ thuật mới, có độ nhạy cao và nhanh chóng có thể chẩn đoán bệnh cho các loài thủy sản. Nó là một hệ thống chẩn đoán có hiệu quả khuếch đại cao với lƣợng DNA đƣợc khuếch đại đến 109-1010 lần trong vòng 15-60 phút sử dụng 4 mồi, hai mồi bên trong và hai mồi bên ngoài. Khuếch đại và phát hiện gen có thể đƣợc hoàn thành chỉ trong 1 bƣớc, bằng cách ủ hỗn hợp mẫu, primers, DNA polymerase ở nhiệt độ cố định (khoảng 65°C). Phƣơng pháp LAMP cho phép phát hiện tác nhân gây bệnh ở nồng độ 1fg so với 10 fg của phƣơng pháp nested PCR.
Các phương pháp dựa trên nguyên lý lai phân tử DNA
Các phƣơng pháp dựa trên nguyên lý lai phân tử DNA bao gồm: Dot blot [32], lai tại chỗ [26], lai southern blot [94], cảm biến sinh học [127]. Nghiên cứu của Shekhar và cộng sự [79] trong việc so sánh độ nhạy của DNA dot blot và PCR cho thấy rằng: mặc dù PCR có độ nhạy cao hơn để phát hiện bệnh, tuy nhiên DNA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dot blot có một lợi thế hơn PCR trong việc có thể áp dụng đối với những mô khó thực hiện PCR do có nhiều yếu tố ức chế nhƣ: cuống mắt, mắt, lớp biểu bì…
b. Phương pháp phát hiện dựa trên phản ứng miễn dịch
Các phƣơng pháp chẩn đoán miễn dịch sử dụng cả hai loại kháng thể đa dòng (PAb) và kháng thể đơn dòng (MAb) đã đƣợc phát triển để phát hiện virus gây bệnh đốm trắng. Một phƣơng pháp dot blot nhanh chóng và đơn giản đã đƣợc phát triển để phát hiện hai loại virus WSV và YHN gây bệnh ở tôm. Ngƣời ta đã thành công trong việc tạo kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú, từ đó sản xuất các que thử nhanh sử dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện sớm virus gây bệnh [80]. Đặc điểm của các phƣơng pháp phát hiện dựa trên phản ứng miễn dịch là giá thành thấp, khả năng phát hiện nhanh và có thể đánh giá mức độ nhiễm bệnh của tôm [127].
c. Phương pháp chẩn đoán khác
Microarray cũng là phƣơng pháp đƣợc sử dụng trong chẩn đoán bệnh tôm. Ứng dụng của Microarray DNA trong thủy sản đã hiểu rõ 30 gen liên quan tới miễn dịch và 6000 gen biểu hiện dự đoán tại các mô của tôm. Phƣơng pháp ứng dụng microarray miễn dịch đã đƣợc áp dụng trong sàng lọc tôm sú bố mẹ có khả năng kháng bệnh. Kết quả cũng chỉ ra mức độ biểu hiện cao của protein hemocyanin trong tôm bố mẹ có khả năng kháng bệnh. Kết quả cũng bộc lộ sự biểu hiện của một số gen miễn dịch (crustin, lysozyme, Mo-penaeidin, transglutaminase and Kazal- type proteinase inhibitor) đã tăng lên đáng kể, sau khi bị lây nhiễm. Phân tích microarray DNA của tôm có thể cung cấp các manh mối quan trọng để nghiên cứu các quy tắc bên trong của tế bào và giữa các gen liên quan tới miễn dịch. Hơn nữa, microarray DNA có thể cũng cung cấp các công cụ hữu ích để nhận diện các gen marker kháng bệnh cho các chƣơng trình chọn giống sạch bệnh và khám phá cơ chế miễn dịch của tôm [58].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sự phát triển của các marker di truyền dựa trên DNA đã có tác động mang tính cách mạng trên di truyền động vật. Với các marker DNA, theo lý thuyết có thể quan sát và khám phá sự đa dạng di truyền trong toàn bộ hệ gen. Các marker di truyền phổ biến trong nuôi trồng thủy sản bao gồm: allozymes, mitochondrial DNA, Restriction Fragment Length Polymophism (RFLP), Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD), Amplified Fragment Length Polymophism (AFLP), microsatellite, SNP, và các marker EST đã đƣợc phát triển ở các mức độ khác nhau trên một số loài tôm [95, 111, 122, 134]. Ứng dụng của các marker DNA đã cho phép tiến bộ nhanh chóng trong nghiên cứu về sự đa dạng di truyền và giao phối cận huyết, nhận diện các loài, và xây dựng bản đồ liên kết di truyền độ phân giải cao đối với các loài thủy sản. nghiên cứu sử dụng những marker di truyền sẽ làm giảm nghi ngờ trong thúc đẩy sự nhận diện của các gen trong các locus tính trạng số lƣợng (QTL). Mở rộng, gia tăng số lƣợng các marker phân tử, xây dựng các bản đồ di truyền với mật độ dày, giải mã toàn bộ hệ gen sẽ cung cấp các công cụ hữu ích nhằm cải thiện ngành thủy sản thông qua các chƣơng trình chọn tạo [19, 21].
Allozyme marker
Allozyme là các dạng alen khác nhau của protein tạo bởi một locus gen đơn, và đƣợc quan tâm nhƣ một marker bởi tồn tại sự đa hình và bởi chúng đại diện cho một protein. Kể từ năm 1960, phân tích allozyme đã trở thành phổ biến nhất trong các phƣơng pháp phân tử trong nghiên cứu di truyền thủy sản và là marker sớm nhất sử dụng trong nghiên cứu di truyền thủy sản.
Trình tự amino acid khác nhau giữa các chuỗi polypeptide của các dạng alen khác nhau của enzyme phản ảnh sự thay đổi trong trình tự của DNA. Tùy thuộc vào bản chất của các phân tử amino acid, kết quả, các protein sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau (dựa trên cả điểm đẳng điện và kích thƣớc) khi di chuyển trên gel tinh bột trong điện trƣờng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Các nghiên cứu gần đây đang cho thấy rằng sự đa hình trong các trình tự hệ gen ty thể cao hơn hệ gen nhân. Hệ gen ty thể có thuộc tính chứa tỷ lệ đột biến cao hơn, điều này có thể là kết quả của sự thiếu cơ chế sửa chữa trong suốt quá trình tái bản và kích thƣớc nhỏ hơn. Hầu nhƣ toàn bộ hệ gen ty thể đƣợc phiên mã ngoại trừ vùng D-loop.
Marker mtDNA đã đƣợc sử dụng và rất phổ biến trong nghiên cứu di truyền giữa các loài thủy sản, một vài marker đƣợc sử dụng để nhận diện loài thủy sản bố mẹ. Trong những ngày đầu nghiên cứu, các marker này kết hợp với allozyme là những thành phần quan trọng để khám phá đặc điểm di truyền của các loài thủy sản. Năm 2004, mtDNA đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu về di truyền quần thể của các loài tôm. Đoạn trình tự 617 giàu AT của hệ gen ty thể đã đƣợc khuếch đại và giải trình tự. Kết quả phân tích cho thấy 15 vị trí đa hình do sự thêm và mất nucleotide, 165 vị trí đa hình do sự thay thế. 100 kiểu gen đơn bội đã đƣợc xác định. Kết quả cho thấy vùng giàu AT nói trên là marker có hiệu quả trong nghiên cứu cấu trúc di truyền và đa dạng di truyền [60].
Tôm giống tự nhiên ở những vùng khác nhau sẽ khác nhau về sức sinh sản, tỷ lệ sinh trƣởng, khả năng chống chịu bệnh và rất nhiều đặc tính khác. Ví dụ nhƣ ở Thái Lan, ấu trùng tôm sinh ra từ tôm giống có nguồn gốc ở vùng biển Andaman có sức sống và sinh trƣởng nhanh hơn ấu trùng tôm sinh ra từ tôm giống có nguồn gốc ở các vùng khác. Những nghiên cứu về mặt di truyền thông qua vùng mtDNA cũng cho thấy quần thể tôm sú ở vùng biển Andaman rất khác biệt so với quần thể tôm sú ở Vịnh Thái Lan [49, 50]. Do đó, việc phân tích, đánh giá cấu trúc di truyền và sự đa dạng của quần thể tôm sú là bƣớc đầu tiên rất quan trọng trong quản lý nghề nuôi trồng tôm sú, cũng nhƣ trong nghiên cứu gia hóa và chọn giống tôm sú.
Năm 2000, toàn bộ genome ty thể lần đầu tiên đƣợc giải mã [96]. Genome ty thể tôm sú có kích thƣớc 15984 bp, bao gồm các gen mã hóa 13 protein, 22 tRNAs và 2 rRNAs. Nhiều nghiên cứu cho thấy các gen ty thể cytochrome oxidase I (COI) và 16S rRNA là những gen bảo thủ, mức độ tiến hóa chậm nên thƣờng đƣợc sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
dụng trong nghiên cứu về tiến hóa ở mức độ loài [52, 91]. Ngƣợc lại, vùng điều khiển của genome ty thể (mtCR hay D-loop) là vùng tiến hóa nhanh, cung cấp nhiều thông tin để phát hiện thêm nhiều kiểu đơn bội (mitochondrial haplotype). D-loop là vùng rất quan trọng với việc đánh giá đa dạng di truyền bên trong và giữa các quần thể của loài [28]. Nghiên cứu gần đây về đa dạng kiểu đơn bội ở các quần thể tôm sú vùng Ấn Độ-Thái Bình Dƣơng dựa trên trình tự đoạn D-loop cho thấy đã có tổng số 262 kiểu đơn bội (haplotype) đƣợc phát hiện trong số 316 cá thể thuộc 8 quần thể khác nhau [99]. Mức độ đa dạng kiểu đơn bội là rất cao trong các quần thể và số lƣợng kiểu đơn bội sẽ còn đƣợc tiếp tục phát hiện thêm nếu phân tích với số lƣợng cá thể và quần thể lớn hơn.
RFLP
Marker RFLP đƣợc xem là chỉ thị đầu tiên trong cuộc cách mạng nghiên cứu về hệ gen, tạo nên sự khác biệt hoàn toàn trong lĩnh vực nghiên cứu về sinh học. Nguyên lý của phƣơng pháp RFLP là việc sử dụng các enzyme nhận biết các vị trí nucleotide đặc hiệu từ 4-8 cặp base (bp) và cắt ở tất cả các vị trí có trình tự đặc hiệu xuất hiện. Với những sự thay đổi về indel, sự thay thế base, và sự sắp xếp lại trình tự DNA làm cho các trình tự nhận biết thay đổi và dẫn tới các đoạn cắt ở các mẫu khác nhau là khác nhau, RFLP có thể cho phép tìm thấy sự khác nhau giữa các cá thể, quần thể và giữa các loài thông qua phƣơng pháp điện di trên gel agarose. Ngoài ra, các đoạn có kích thƣớc khác nhau còn có thể đƣợc phát hiện sử dụng phƣơng pháp phân tích Southern blot, trong đó, DNA đƣợc cắt nhỏ, đƣợc phân tách thông qua điện di trên gel agarose, tiếp đó sản phẩm đƣợc chuyển qua màng và lai với các mẫu dò có đánh dấu.
Phƣơng pháp phân tích mtRFLP đã đƣợc các nhà nghiên cứu sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể tôm sú ở các vùng khác nhau. Sự khác biệt di truyền khá rõ ràng giữa quần thể tôm sú ở hai vùng ven biển Đông
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
và Tây Australia đƣợc đánh giá dựa trên kết quả phân tích RFLP của mtDNA [23]. Năm 1999, các nhà nghiên cứu Thái Lan cũng sử dụng kỹ thuật RFLP đã tiến hành đánh giá sự đa dạng di truyền của ba quần thể tôm sú thuộc vùng biển Amanda và Vịnh Thái Lan [49]. Phƣơng pháp này tiếp tục đƣợc sử dụng rộng rãi để khảo sát các quần thể tôm sú ở Thái Lan [50], ở các vùng thuộc Ấn Độ- Thái Bình Dƣơng [22] và ở Việt Nam [10].
RAPD
RAPD lần đầu đƣợc phát triển vào năm 1990 sử dụng dụng PCR để khuếch đại ngẫu nhiên các trình tự hệ gen nhân với các cặp primer có kích thƣớc từ 8-10 bp. Chính bởi các cặp primer có kích thƣớc ngắn và tƣơng ứng là nhiệt độ gắn mồi thấp thƣờng chỉ khoảng 36-40oC, và khả năng khuếch đại một hỗn hợp các đoạn DNA là rất lớn, với mỗi sản phẩm đại diện cho một locus khác nhau. Với những sự thay đổi về indel, sự thay thế base, và sự sắp xếp lại trình tự DNA làm cho các trình tự giữa các mẫu khác nhau có sự khác nhau, vì vậy RAPD có khả năng tƣơng đối cao trong việc phát hiện sự đa hình.
Năm 2011, nhóm tác giả Rezvani đã sử dụng marker RAPD để xác định tính trạng sinh trƣởng di truyền của tôm thẻ đuôi đỏ Fenneropenaeus indicus. 90 cá thể tôm ở giai đoạn Postlarvae là sản phẩm của tôm bố mẹ ở các giai đoạn khác nhau từ 1 ngày cho đến 4 tháng đƣợc chọn làm vật liệu nghiên cứu. Tôm đƣợc chia thành 3 nhóm: sinh trƣởng nhanh, sinh trƣởng bình thƣờng và sinh trƣởng chậm (dựa vào khối lƣợng và kích thƣớc). Các cặp mồi RAPD đƣợc sử dụng gồm OPAQ 4,7,9 tuy nhiên OPAQ 4 cho thấy mức độ đa dạng cao nhất với khoảng cách di truyền cao nhất là 0,457 và thấp nhất là 0,091 [77]. Ở Việt Nam, năm 2003, nhóm tác giả Quyền Đình Thi đã sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích đa hình tôm sú (Penaeus monodon). Kết quả nghiên cứu đã chỉ ra mức độ đa hình trong tập hợp mẫu phân tích và khả năng ứng dụng kỹ thuật RAPD trong đánh giá đa dạng di truyền [10].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Kỹ thuật AFLP đƣợc hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA đƣợc nhân lên có định hƣớng sau khi bị cắt bởi 2 enzyme giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP là một trong những kỹ thuật nhận dạng vân tay DNA đƣợc phát triển bới Vos và cộng sự năm 1995. Kỹ thuật này là một công cự hữu ích để xác định nhiều locus đa hình mà không cần phải biết trƣớc thông tin về trình tự DNA của chúng, phƣơng pháp này có thể đƣa ra nhanh chóng một ƣớc lƣợng về mức độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau. Trong nghiên cứu của Ventura 2011, một marker DNA đặc hiệu của tôm cái đã đã phát hiện thông qua kỹ thuật AFLP trên hơn 200 cá thể tôm. Vùng trình tự đƣợc coi là marker có tổng kích thƣớc vào khoảng 3 kb, và có khả năng nhận diện đƣợc giới tính các cá thể [132].
Năm 2011, Vos và cộng sự đã nghiên cứu thiết lập bản đồ di truyền của loài
Artemia franciscana dựa trên kỹ thuật AFLP. bản đồ liên kết di truyền là cơ sở của tạo bản đồ các locus tính trạng số lƣợng (QTL) hỗ trợ chọn giống. Đến năm 2013, nhóm tác giả này đã công bố bản đồ hoàn chỉnh đầu tiên của loài này, trong đó 8 marker di tuyền liên kết với giới tính đã đƣợc xác định [108]. Ngoài ra, bản đồ liên kết đã đƣợc tạo ra đối với một số loài tôm và hầu hết đƣợc tạo lập bằng phƣơng pháp AFLP [83, 102]. Đối với tôm sú, năm 2005, 6 marker trong đó có 1 marker liên kết với giới tính đã đƣợc nhóm tác giả Khammamtong phát hiện thông qua kỹ