- Chuẩn bị: dụng cụ nghiền mẫu (Hình 2.2) đƣợc ngâm rửa trong dung dịch nƣớc chứa 0.1% DEPC. Sau đó, dụng cụ đƣợc khử trùng 20 phút ở nhiệt độ 120oC và áp suất cao.
- Mẫu mô tôm sú đƣợc giữ trong nitơ lỏng, đƣợc chuyển nhanh sang dụng cụ
nghiền mẫu. Bổ sung dung dịch TRIzol (Invitrogen) vào dụng cụ nghiền mẫu với tỷ lệ 100 mg mẫu: 1 ml TRIzol.
- Đặt dụng cụ nghiền lên một hộp xốp đựng nƣớc đá và thực hiện thao tác nghiền mẫu cho đến khi mẫu mô tôm sú nhuyễn mịn trong dung dịch TRIzol.
- Sau khi nghiền mẫu xong, chuyển hỗn hợp TRIzol từ dụng cụ nghiền mẫu sang các ống Eppendorf 1,5 ml với thể tích khoảng 1 ml/ 1 ống (mỗi ống Eppendorff tƣơng đƣơng với 1ml TRIzol bổ sung ban đầu).
Hình 2. 2. Dụng cụ nghiền mẫu (Homogenizer)
- Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng 10 phút.
- Bổ sung 0,2 ml Chloroform vào mỗi ống (theo tỉ lệ 0, 2ml Chloroform /1 ml TRIzol bổ sung ban đầu). Lắc mạnh ống bằng tay hoặc vortex trong 15-20 giây sau đó chuyển sang máy ly tâm, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4o
C.
- Sau khi ly tâm xong, hút dịch ở pha trên một cách cẩn thận chuyển sang ống Eppendorf 1,5 ml sạch. (Pha trên là pha nƣớc có chứa RNA tổng số)
- Bổ sung 0,5 ml Isopropyl alcohol (2-propanol) vào mỗi ống (theo tỉ lệ 0,5 ml Isopropyl alcohol /1ml TRIzol bổ sung ban đầu). Ủ mẫu ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tủa RNA tổng số.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Bổ sung 1ml Ethanol 70% vào mỗi ống để rửa tủa RNA. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút ở 4oC và loại bỏ dịch. Lặp lại bƣớc rửa thêm một lần nữa.
- Làm khô tủa RNA tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong khoảng 15 phút .
- Hòa tan RNA tổng số trong 200 µl nƣớc hoặc dung dịch TE đã đƣợc xử lý DEPC. - Kiểm tra RNA tổng số bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% và đo quang phổ ở bƣớc sóng 260nm.
- Bảo quản RNA tổng số ở -80oC.