* Tách chiết plasmid tái tổ hợp
- Một khuẩn lạc trên đĩa thạch đƣợc cấy lắc qua đêm trong 2 ml môi trƣờng LB có Kanamycin (nồng độ 50 g/ml) ở 37oC, 200 vòng/phút.
- Chuẩn bị các dung dịch sau: Sol I: 50 mM Glucose 25 mM Tris-HCl (pH = 8,0) 10 mM EDTA (pH = 8,0) Sol II: 0,2 N NaOH 1% SDS Sol III: 60 ml Kali acetate 5M 11,5 ml acetic acid 28,5 ml H2O
- Chuyển dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang ống Eppendorf 1,5 ml. Ly tâm dịch nuôi cấy trên ở 6000 vòng/phút trong 7 phút để thu tế bào.
- Hòa cặn tế bào vi khuẩn trong 150 l dung dịch Sol I để lạnh, voltex làm tan cặn tế bào, sau đó giữ trong đá 5 phút.
- Bổ sung 150 l dung dịch Sol II, đảo đầu ống Eppendorf nhẹ nhàng. cfu/ml =
Số lƣợng khuẩn lạc x Nồng độ pha loãng Lƣợng cấy trải
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Thêm 150 l dung dịch Sol III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 5 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Chuyển phần dung dịch sang ống Eppendorf mới - Bổ sung 2 l RNase, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
- Bổ sung 500 l hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alchohol (24: 1), voltex mẫu rồi ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC. Chuyển pha nƣớc ở phía trên sang một ống Eppendorf mới.
- Bổ sung 1 ml cồn 100% và 50 l Natri acetate 3 M (pH 5,2). Đảo đều và giữ lạnh ở -20o
C trong 3 giờ. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC để thu tủa plasmid DNA.
- Rửa tủa bằng 0,5 ml cồn 70%, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, sau đó đổ bỏ cồn.
- Làm khô tủa bằng máy SpeedVac trong 5 phút. Hòa tan tủa plasmid DNA trong 50 l nƣớc. Bảo quản DNA ở -20oC. Kiểm tra DNA bằng điện di trên gel agarose 0,8 %.
* Cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn
Trên vector có chứa trình tự cắt của enzyme giới hạn BsrGI đây là enzyme có tần số lặp lại rất thấp cho nên có thể sử dụng để kiểm tra các đoạn chèn bằng phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn này.
Thành phần phản ứng nhƣ sau: Plasmid DNA 5 µl 10x buffer 1 µl Enzyme BsrGI 0,2 µl H2O 3,8 µl Tổng thể tích 10 µl
Trộn đều mẫu, ủ ở 37oC trong 3 giờ. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt trên gel agarose 0,8 %.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Vector pDONR222 đối chứng (chƣa thực hiện phản ứng BP) sẽ có 3 vị trí nhận biết của enzyme giới hạn BsrGI, khi tiến hành phản ứng cắt sẽ cho ra 3 băng có kích thƣớc lần lƣợt 2,5 kb; 1,4 kb và 790 bp. Đối với mẫu đã xảy ra phản ứng tái tổ hợp giữa vector pDONR222 với đoạn cDNA mới tạo, khi tiến hành phản ứng cắt với enzyme giới hạn BsrGI sẽ cho ra một băng 2,5 kb (vector backbone) và một hoặc nhiều băng có kích thƣớc không trùng lặp với đối chứng.