2.2.2.1. Nguyên lý
mRNA (có đuôi PolyA+
ở đầu 3‟) đƣợc tinh sạch bằng cách sử dụng bộ kit “ PolyAtract® mRNA Isolation Systems III” (Promega). Nguyên lý của quá trình tinh sạch đƣợc thể hiện ở Hình 2.3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2. 3. Sơ đồ nguyên lý quá trình tinh sạch mRNA từ RNA tổng số 2.2.2.2. Tiến hành:
- Chuẩn bị lƣợng RNA tổng số (khoảng 0,1 – 1 mg) chứa trong ống Eppendorf 1,5 ml. Bổ sung thêm nƣớc cất đã khử bằng RNAse tới thể tích 500 µl.
- Ủ mẫu ở 65oC trong 10 phút.
- Bổ sung 3 µl mẫu dò Biotinylated_Oligo(dT) Probe và 13 µl dung dịch 20X SSC vào mẫu, trộn nhẹ rồi đem ủ ở nhiệt độ phòng đến khi nhiệt độ hỗn hợp hạ xuống (khoảng 10 phút).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Pha 1,2 ml dung dịch 0,5 X SSC bằng cách bổ sung 30 µl dịch 20X SSC vào 1,170 ml nƣớc cất đã khử RNAse
Pha 1,4 ml dung dịch 0,1X SSC bằng cách bổ sung 7 µl dịch 20X SSC vào 1,393 ml nƣớc cất đã khử RNAse
- Sau khi chuẩn bị xong 2 dung dịch 0,5 X SSC và 0,1 X SSC, tiến hành bƣớc rửa hạt sắt từ Streptavidin-Paramagnetic Particles (SA-PMPs). Các hạt sắt từ SA-PMPs cần đƣợc giữ ổn định trong dung dịch đệm chứa BSA, dung dịch này cần đƣợc loại bỏ trƣớc khi làm các bƣớc thực hiện tiếp theo. Bƣớc rửa hạt sắt từ đƣợc thực hiện nhƣ sau: Đầu tiên, búng nhẹ ống hạt sắt từ để các hạt phân tán đều trong dung dịch tiếp đó chuyển ống hạt sắt từ lên trên cột nam châm. Sau khoảng 5 giây các hạt sắt từ sẽ bị hút về phía thanh nam châm. Dùng pipette để hút loại bỏ toàn bộ dung dịch trong ống. Tiếp đến, chuyển ống ra khỏi cột trộn, bổ sung 300 µl dung dịch 0,5X SSC, trộn đều nhẹ nhàng để rửa hạt, sau đó lại chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm rồi hút loại bỏ dịch rửa. Lặp lại bƣớc rửa này 2 lần nữa để chắc chắn toàn bộ dịch đệm bảo quản đã đƣợc loại bỏ. Cuối cùng, bổ sung 100 µl dung dịch 0,5X SSC và trộn đều nhẹ để các hạt khuếch tán đều trong dung dịch.
- Bổ sung 500 µl RNA tổng số vào trong 100 µl dung dịch chứa hạt sắt từ đã qua xử lý. Hạt sắt từ bọc Streptavidin sẽ tƣơng tác với Biotin đã gắn với mẫu dò Oligo(dT). Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút búng nhẹ mỗi 1-2 phút/lần.
- Tiếp đến chuyển ống dung dịch lai lên cột nam châm để loại bỏ dịch. Ở bƣớc này, mRNA đã đƣợc gắn vào bề mặt hạt sắt từ.
- Rửa hạt sắt từ đã gắn mRNA bằng dung dịch 0,1X SSC nhƣ sau: bổ sung 300 µl dung dịch 0,1X SSC, trộn đều nhẹ nhàng, sau đó chuyển ống chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm rồi hút loại bỏ dịch rửa. Lặp lại bƣớc rửa này 2 lần với các thao tác tƣơng tự.
- Bổ sung 100 µl nƣớc cất đã khử RNAse, trộn đều nhẹ nhàng để các hạt sắt từ khuếch tán đều trong dung dịch. Với bƣớc này, mRNA đƣợc hòa tan lại trong
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
nƣớc. Tiếp theo, đƣa ống mẫu chứa các hạt sắt từ lên cột nam châm. Sau khi các hạt sắt từ đã bị hút hoàn toàn về một phía, tiến hành hút toàn bộ phần dung dịch chứa mRNA chuyển sang ống ống Eppendorf 1,5 ml mới, giữ mẫu tạm thời trên đá. Tiếp tục bổ sung 150 µl nƣớc nƣớc cất đã khử RNAse vào ống chứa các hạt sắt từ vừa rồi và lại tiếp tục lặp lại bƣớc trên để thu lấy dung dịch chứa mRNA còn lại rồi chuyển toàn bộ dịch thu đƣợc vào 100 µl dịch trƣớc đó (tổng thể tích 250 µl).