Cú nhiều hợp chất hoỏ học ủược sử dụng ủể kớch thớch dung hợp tế bào trần thực vật bao gồm: NaCl, KCl, NaNO3, KNO3, polyvinyl alcohol, polyethylen glycol… Ngoài ra cú thể tiến hành dung hợp bằng dũng ủiện, huyết thanh miễn dịch.
- Xử lý với NaNO3
Năm 1970, Power và cộng sự ủó dựng NaNO3 (0,25 M) kớch thớch dung hợp hai protoplast. Carlson và cs (1972) cũng dựng phương phỏp này ủể sản xuất cõy lai soma ủầu tiờn (Nicotiana glauca ì N. langsdorffii). Tuy nhiờn, phương phỏp này cho hiệu suất thấp vỡ NaNO3 khụng thớch hợp với tế bào bị khụng bào húa mạnh như protoplast từ nhu mụ lỏ.
- Xử lý với nồng ủộ ion Ca2+ cao và pH cao
Hỗn hợp tế bào trần từ thịt lỏ ủược ủ trong mụi trường kiềm mạnh cú nồng ủộ 0,05M CaCl2, 0,4M 9% (w/v) manitol, pH cao (8-10) và ly tõm nhẹ ở 50g trong 3 phỳt, tiếp theo ủem ủ trong nước ở nhiệt ủộ 370C trong 45 phỳt.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 24
Bằng phương phỏp này, Keller và Melcher (1973) ủó dung hợp thành cụng tế bào trần từ mụ dậu của hai dũng thuốc lỏ. Tuy nhiờn giỏ trị pH cao cú thể gõy ủộc cho tế bào trần của một số loài tế bào thực vật (Kao va Wetter, 1977).
- Xử lý với polyethylen glycol (PEG)
PEG là một polyme, do ủú khối lượng phõn tử phụ thuộc vào cỏc ủiều kiện của phản ứng trựng hợp: PEG 1540 (MW 1300-1600), PEG 4000 (MW 3000-5000), PEG 6000 (MW 6000-8000). Thường dựng PEG 6000 cú nồng ủộ 20-30% ủể xử lý cỏc tế bào trần. Theo Wallin và cộng sự (1974), PEG ủược ứng dụng rộng rói trong dung hợp tế bào trần thực vật do cú ủộc tớnh thấp, ủồng thời cú tỏc dụng với hầu hết cỏc kiểu tế bào.
Kao và Mychayluk (1974) lần ủầu tiờn cụng bố ủó sử dụng PEG ủể dung hợp protoplast. Hỗn hợp cỏc protoplast sau khi tỏch ủược ủ trong PEG với trọng lượng phõn tử cao và ion Ca2+ với nồng ủộ thấp hơn, khoảng 0,6ml dung dịch PEG (hũa tan 1g PEG 1500 trong 2ml + gluco 0,1M, CaCl2 10mmol, KH2PO4 0,7mmol) sau ủú nhỏ giọt protoplast vào ống eppandoff, ủậy nắp và quấn parafin, ủ ở nhiệt ủộ phũng trong 40 phỳt. Lắc ống ủể cho cỏc protoplast tiếp xỳc với nhau. Sau ủú rửa PEG bằng mụi trường nuụi protoplast, cứ 10 phỳt lại bổ sung 0,5-10ml. Rửa PEG bằng cỏch ly tõm nhẹ ủể cỏc protoplast sẽ tỏi lơ lửng trờn mụi trường nuụi cấy.
Nồng ủộ và trọng lượng phõn tử của PEG quyết ủịnh sự thành cụng của thớ nghiệm dung hợp. PEG cú trọng lượng phõn tử thấp (~ 100) khụng thể tạo ra một sự dớnh chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phõn tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cựng với pH/Ca2+ cú hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của cỏc protoplast.
Cơ chế tỏc ủộng của PEG vẫn chưa ủược biết ủến một cỏch rừ ràng. Cú nhiều ý kiến cho rằng hoạt ủộng của phõn tử PEG giống như một cầu nối phõn tử, nhờ ủú mà nú làm phõn ró cỏc sợi liờn bào và kớch thớch sự kết tụ cỏc tế bào lại với nhau. ðồng thời do cú trọng lượng phõn tử cao của PEG sẽ kớch
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 25
thớch sự kết tụ của cỏc phõn tử protein và lypit (thành phần chớnh cấu trỳc lờn màng sinh chất), do ủú kớch thớch cỏc tế bào kết tụ lại với nhau. Nếu PEG cú trọng lượng phõn tử thấp sẽ khụng tạo ra sự kết dớnh.
Sau khi xử lý bằng tỏc nhõn dung hợp, cỏc protoplast ủược nuụi cấy theo phương thức chuẩn. PEG cú 2 tỏc dụng: hoặc cung cấp một cầu nối ủể Ca2+
cú thể liờn kết cỏc bề mặt màng với nhau hoặc dẫn ủến sự rối loạn tớch ủiện bề mặt màng trong suốt quỏ trỡnh rửa giải.
Phương phỏp sử dụng PEG cú hiệu quả ủối với nhiều trường hợp khi dung hợp protoplast của cỏc cõy cựng loài và khỏc loài, dung hợp tế bào ủộng vật và cả trường hợp dung hợp protoplast thực vật với tế bào ủộng vật (Pontecorvo, 1975; Jone và cộng sự, 1976; Dudits và cộng sự, 1976; Vasil, 1976). Cơ chế của quỏ trỡnh dung hợp ủó ủược Nagata và Melchers nghiờn cứu tỉ mỉ (Nagata và Melchers, 1978).
- Dung hợp xung ủiện
Phương phỏp này ủơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng húa chất. ðiều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng ủiện (electrofusion) khụng gõy ủộc ủối với tế bào như thường thấy ở cỏc protoplast hoặc cỏc thể dị nhõn ủược xử lý bằng PEG. Người ta ủó dựng cỏc xung ủiện (electric pulses) ủể ủưa trực tiếp DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật, kỹ thuật này ủó làm tăng sự quan tõm về việc ứng dụng dung hợp bằng ủiện vào lĩnh vực di truyền tế bào soma.
Nguyờn tắc của phương phỏp dung hợp này là: mụi trường chứa protoplast ủược ủặt giữa hai ủiện cực, sự dung hợp xảy ra khi ta tạo ra một xung ủiện với ủiện thế cao (500 – 1000 V/cm) trong 5-6/1000 giõy. Xung ủiện ỏp cao tạo ra sự phỏ vỡ thuận nghịch của màng nguyờn sinh chất ở vị trớ tiếp xỳc của cỏc tế bào, tạo ra sự dung hợp và tỏi tổ chức lại màng một cỏch hợp lý. Một quỏ trỡnh hoàn chỉnh bắt ủầu từ lỳc ủưa cỏc protoplast vào bờn
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 26
trong ngăn và chuyển chỳng lờn mụi trường nuụi cấy, cú thể ủược hoàn chỉnh trong 5 phỳt hoặc ớt hơn.
Hiệu quả của phương phỏp phụ thuộc vào nhiều yếu tố: mật ủộ protoplast, nhiệt ủộ khi thớ nghiệm, cường ủộ ủiện trường, nguồn vật liệu cho protoplast (tế bào mụ lỏ thường thớch hợp hơn là mụ sẹo hoặc rễ cõy) … [3]. Nguồn protoplast cũng ủúng một vai trũ quan trọng, protoplast cú nguồn gốc từ mụ lỏ thỡ tần số dung hợp xảy ra cao hơn so với cỏc nguồn protoplast khỏc [11].
Senda và cộng sự (1979) là những người ủầu tiờn nghiờn cứu theo hướng dung hợp bằng ủiện ở Rauwolfia, quỏ trỡnh dung hợp ủó thực hiện thành cụng khi dựng xung ủiện 5-12 amp DC. Sau ủú, Zimmermann và Scheurich (1981), cũng ủó chứng minh rằng cỏc protoplast cú thể dung hợp bằng ủiện trường và ủưa ra một protocol cú thể sử dụng rộng rói.
Cỏc thể dị nhõn hỡnh thành nhờ dung hợp bằng ủiện ủó phõn chia trong mụi trường nuụi cấy và cú khả năng tỏi sinh chồi hoặc cõy lai soma, bao gồm:
Nicotiana tabacum (+) N. tabacum, N. plumbaginifolia (+) N. tabacum, N. glauca (+) N. langsdorfii, và Solanum tuberosum (+) S. phureja. Một số tổ hợp lai protoplast ủó hỡnh thành callus như: Brassica napus (+) B. napus và
Solanum brevidens (+) N. rustica.
Buồng dung hợp cú 2 ủiện cực song song ủược nối với mỏy dao ủộng tần số cao (mỏy phỏt ủiện súng hỡnh sine hoặc trường AC) và mỏy phỏt ủiện xung DC.
Cỏc protoplast thịt lỏ của cõy thuốc lỏ xếp thành chuỗi ngọc trai dưới ảnh
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 27