và ngay trong việc sử dụng cựng một loại dung dịch enzmy ủể tỏch cho từng dũng khoai tõy khỏc nhau thỡ cũng thu ủược số lượng protoplast là khỏc nhau. Số protoplast tỏch ủược dao ủộng dũng khoảng 5,83x105P/ml của dũng B186 với dung dịch enzym II ủến ủạt số lượng lớn nhất là 36.67x105P/ml của dũng H195 với dung dịch enzym II. Dung dịch emzym I cho hiệu quả tỏch ủạt cao nhất với những dũng A56 là 30.83x105, H34 là 31,26 x 105, B208 32.67x105 và B186 là 26.67x105.
Như vậy chỳng ta cú thể kết luận rằng dung dịch enzym I tỏch phự hợp với nhiều giống nhất.
- Dung dịch enzym I cú tỷ lệ M/C=0.2g/0.8g/100ml là tối ưu cho tỏch protoplast của dũng A56, H34, B208, B186 ủạt tỷ lệ cao nhất.
- Dung dịch enzym II cú tỷ lệ M/C=0.1g/0.6g/100ml phự hợp tỏch cho dũng H195 ủạt tỷ lệ cao nhất là 36,67x105P/ml.
- Dung dịch enzym III cú tỷ lệ M/C=0.1g/0.8g/100ml là tối ưu cho việc tỏch protoplast của dũng A15, với tỷ lệ 26.67x105P/ml và dũng A1628.24x105P/ml.
4.2. Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu suất tỏch protoplast. protoplast.
Việc phải tỡm ra dung dịch enzym phự hợp cho việc tỏch potoplast của từng giống ủể ủạt hiệu suất cao nhất quả là quan trọng. Song bờn cạnh ủú thỡ việc tỡm ra ủược thời gian ủ enzym thớch hợp cho từng giống cũng quan trọng khụng kộm. Bởi lẽ thời gian ủ enzym ảnh hưởng khụng nhỏ ủến hiệu suất tỏch protoplast. Sự hoạt ủộng của mỗi enzym với mỗi giống cần 1 thời gian ủ nhất ủịnh, nếu thời gian ủ khụng ủủ nõu thỡ số lượng protoplast thu ủược khi tỏch sẽ thấp. Từ ủú dẫn tới hiệu suất tỏch sẽ thấp, cũn nếu thời gian ủ quỏ lõu sẽ gõy ngộ ủộc cho tế bào dẫn tới tế bào bị vỡ nhiều do ủú hiệu suất tỏch cũng sẽ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 39
thấp (do macerozym rất ủộc cho tế bào). Chớnh vỡ vậy mà chỳng tụi ủó tiến hành thớ nghiệm nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian ủ enzym cho từng giống.
Bảng 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch Proptoplast dũng A15 Enzym Thời gian Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h 9.17x105 6.67x105 10.83x105 14h 10.83x105 6.67x105 24.17x105 15h 12.5x105 8.33x105 26.67x105 16h 6.67x105 5.83x105 18.33x105 Sau 13h ủ Sau 14h ủ Sau 15h ủ Sau 16h ủ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 40
Kết quả Bảng 2 cho ta thấy ảnh hưởng rừ rệt của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch protoplast dũng A15. Trong bốn khoảng thời gian tiến hành theo dừi (13h, 14h, 15h, 16h), thỡ tỷ lệ protoplast dao ủộng trong khoảng từ 5.83x105P/ml - với dung dịch enzym II ở thời gian ủ 16h - ủến 26.67x105P/ml - Với dung dịch enzym II và 15h ủ. Khi ủ 15h với dung dịch enzym III cú tỷ lệ protoplast tỏch ủược là cao nhất 26.67x105P/ml, protoplast trũn ủều và ủẹp. Với 16h ủ thỡ protoplast thu ủược bị vỡ nhiều. Nhưng với từng thời gian ủ khỏc nhau thỡ cũng với dung dịch enzym ủú ta thu ủược tỷ lệ protoplast khỏc nhau: Sau 13h cú 10.83x105P/ml, sau 14h là 24.17x155P/ml, sau 15h ủ ủạt 26.67x105P/ml và sau 16h ta cú 18.33x105P/ml. Như vậy ta ủó xỏc ủịnh ủược dung dịch enzym III với 15h ủ là tối ưu cho việc tỏch protoplast.
Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến khả năng tỏch Proptoplast dũng A186
Enzym Thời gian
Dung dịch I
(P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h 10.33x105 6.67x105 9.17x105 14h 17.5x105 10.83x105 10.0x105 15h 26.67x105 12.5x105 15.83x105 16h 18.33x105 7.5x105 9.17x105 Sau 13h ủ sau 14h ủ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 41
Sau 15h ủ sau 16h ủ
Hỡnh 4. Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu suất tỏch protoplast dũng khoai tõy B186 (protoplast ngay sau khi tỏch, soi ở vật khớnh 40).
ðối với dũng B186 chỳng tụi cũng tiến hành thớ nghiệm với cỏc mức thời gian ủ là 13h, 14h, 15h, 16h và thu ủược kết quả. Với cựng dung dịch enzym I nhưng với thời gian ủ khỏc nhau thỡ tỷ lệ Protoplast thu ủược cũng khỏc nhau ở 13h nồng ủộ protoplast ủạt 10,33x105, ở thời gian ủ là 14h thỡ tỷ lệ protoplast ủạt là 17,5x105, ở thời gian ủ 15h tỷ lệ protoplast ủạt 26,67x105 và ở 16h thỡ tỷ lệ protoplast là 18,33x105. Cũn với dung dịch enzym II và III là 2 enzym khụng thớch hợp cho việc tỏch thỡ tỷ lệ protoplast thu ủược thấp hơn dao ủộng trong khoảng 6,67x105 ủến 15,83x105. Như vậy chỳng tụi ủưa ra nhận xột với giống B186 ở thời gian ủ 15h với dung dịch enzym I cho tỷ lệ protoplas ủạt ủược là cao nhất.
Bảng 4: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến khả năng tỏch Proptoplast dũng H195 Enzym Thời gian Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h 10.83x105 12.50x105 9.5x105 14h 9.21x105 36.67x105 8.68x105 15h 17.6x105 23.33x105 10,83x105 16h 18.33x105 10.0x105 9.17x105
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 42
Qua số liệu bảng chung ta thấy với dung dịch enzym II thì thời gian ủ ở 14h cho hiệu suất tách protoplast là cao nhất đạt 36,67x105p/ml còn ở thời gian ủ 16h thì hiệu suất tách protoplast thấp nhất chỉ đạt 10,0x105p/ml do thời gian ủ quá lâu nên các TB bị ngộ độc và chết nhiều nên mật độ protoplast là thấp nhất.
Còn với dung dịch enzym I và enzym II là dung dịch không thích hợp cho việc tách. Thì với dung dịch enzym I mật độ protoplast biến động từ 9,21x105 đến 18,33x105. Và với dung dịch enzym I mật độ protoplast biến động từ 8,68x105 đến 10,83x105
Nh− vậy qua số liệu bảng 2 chúng tôi nhận xét với giống H195. ở thời gian ủ 14h với dung dịch enzym II là thích hợp nhất cho việc tách protoplast.
13h 14h
15h 16h
Hình 5. ảnh h−ởng của thời gian ủ enzym đến khả năng tách protoplast dòng khoai tây H195
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 43
Qua số liệu bảng chỳng ta thấy với dung dịch enzym II thỡ thời gian ủ ở 14h cho hiệu suất tỏch protoplast là cao nhất ủạt 36,67x105p/ml cũn ở thời gian ủ 16h thỡ hiệu suất tỏch protoplast thấp nhất chỉ ủạt 10,0x105p/ml do thời gian ủ quỏ lõu nờn cỏc TB bị ngộ ủộc và chết nhiều nờn mật ủộ protoplas là thấp nhất.
Cũn với dung dịch enzym I và enzym II là dung dịch khụng thớch hợp cho việc tỏch. Thỡ với dung dịch Enzym I mật ủộ protoplast biến ủộng từ 10,83x105 ủến 19,21x105. Và với dung dịch enzym III mật ủộ protoplast biến ủộng từ 9,17x105 ủến 13,33x105.
Như vậy số lượng bảng cho ta nhận xột rằn. với giống H195 ở thời gian ủ 14h và với dung dịch enzym II là thớch hợp nhất cho việc tỏch protoplast.
Bảng 5: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến khả năng tỏch Proptoplast dũng A56
Enzym Thời gian
Dung dịch I
(P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h 13.62x105 9.87x105 12.56x105
14h 30.83x105 19.17x105 15.38x105 15h 18.33x05 10.56x105 14.47x105 16h 10.33x105 8.67x105 9.17x105
Nhỡn vào số liệu bảng ta thấy với dung dịch enzym I ở thời gian ủ từ 13h -> 16h nồng ủộ protoplast thu ủược là khỏc nhau ủạt cao nhất ở 14h ủ là 30,83x105p/ml. và thấp nhất ở 16h ủ là 10,33x105p/ml. Cũn với dung dịch enzym II cũng thời gian ủ từ 13h –> 16h mật ủộ protoplast dao ủộng từ 8, 67x105 ở 16h ủến 19,17x105 ở 14h. Và cũng với thời gian ủ như thế với dung dịch enzym III tỷ lệ protopast dao ủộng từ 9,17x105 ở 16h ủến 15,38x105 ở 14h. Như vậy với dũng A56 thỡ thời gian ủ là 14h với dung dịch enzym I là thớch hợp nhất cho việc tỏch protoplast.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 44
Bảng 6: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến khả năng tỏch Proptoplast dũng A16 Enzym Thời gian Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h . 12.67x105 9.86x105 16.68x105 14h 18.26x105 16.36x105 28.24x105 15h 16.68x05 15.83x105 20.38x105 16h 6.67x105 10.33x105 18.33x105
Qua số liệu bỏn cho chỳng ta thấy giống A16 ở thời gian ủ là 14h. và với dung dịch enzym III cho tỷ lệ protoplast thu ủược là cao nhất ủạt 28,24x105. Cũn với thời gian ủ khỏc cũng với dung dịch enzym III thỡ tỷ lệ protoplast thu ủược là thầp hơn so với thời gian ủ quỏ lõu thỡ cỏc TB sẽ bị vỡ dần tới cỏc protoplast khụng cũn ủược nguyờn vẹn và trũn ủều cũn với thời gian ủ là 13h thỡ chưa ủủ ủể phõn giải cỏc TB ra khỏi mụ lỏ dẫn ủến tỷ lệ protoplast thấp:
Với thớ nghiệm này chỳng tụi ủưa ra nhận xột: Rằng hiệu xuất tỏch của mỗi giống khụng chỉ phụ thuộc vào từng Enzym mà cũn phụ thuộc rất lớn tới thời gian ủ.