Năm 1980 các nghiên cứu đJ cho thấy đ−ợc ph−ơng pháp tinh vi mở rộng trong tái tạo lại cây nguyên vẹn từ gia tăng vững chắc số loài cây và trong sản xuất tế bào lai sinh d−ỡng và Cybrids, ví dụ nh− các cá thể khác loài không có khả năng giao phối, Petunia parodii và Petunia parviflora (Power,1980). Quy trình đ−ợc phát triển để tái tạo lại cây nguyên vẹn từ tế bào trần cô lập, không chỉ cho cây lúa mà còn ở cà chua, đậu nành, hạt lanh, cải bắp, rau diếp và các cây lai sinh d−ỡng giữa các loài khác nhau, có bộ máy di truyền khác nhau của Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Glycine, Citrus, Brassica, Medicago và Trifolium spp (Bajaj, 1989). Thêm vào đó các quy trình đ−ợc phát triển xa hơn cho các kĩ thuật vi tiêm, dung hợp bằng điện, Flow cytometry, hấp thu và tích hợp ADN, cô lập nhân và nhiễm sắc thể từ tế bào trần (Bajaj, 1989).
Việc khám phá ra tế bào trần có thể bị nhiễm bởi virus khảm thuốc lá (Cooking và Pojinar, 1969) kích thích sự quan tâm về vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà đỉnh điểm là sự biểu hiện của Plasmid Ti trong vi khuẩn Agrobacterium gây khối u, đ−ợc đ−a vào tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp bằng chứng đầu tiên về vai trò độc lập của Plasmid Ti ở khía cạnh này (Davey, 1980). Điều này mở đ−ờng cho việc sử dụng Plasmid chuyển nạp trực tiếp cho tế bào trần để từ đó dẫn đến việc tạo ra đ−ợc các loại rau, ngũ cốc chuyển gen cũng nh− các vụ thu hoạch cây trồng bằng chuyển nạp trực tiếp
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 20
ADN cho tế bào trần bao gồm các loại lúa chuyển gen (chuyển nạp bằng xung điện vào tế bào trần lúa) có khả năng sinh sản (Zang,1988).
Những nghiên cứu trên cây lúa chuyển gen minh hoạ vai trò của tế bào trần trong việc biến đổi tế bào ngũ cốc và làm cho vấn đề phân tử và tế bào tiếp cận nhau hơn. Sự t−ơng tác giữa virus với tế bào trần cô lập minh chứng poly –L- ornithine kích thích sự lây nhiễm, trong khi các nghiên cứu tiếp theo xác nhận rằng PEG cũng gia tăng sự thu hút virus và axit nhân của virus vào trong tế bào trần (Davey,và Kumar, 1983). Những năm cuối thập niên 1970 đầu thập niên 1980 là thời gian phối hợp giữa các kĩ thuật xác định Plasmid Ti có thể chuyển nạp hay không vào tế bào trần thực vật. Các nghiên cứu bao gồm sự t−ơng tác của cấu trúc siêu xoắn của Plasmid Ti từ dòng octopine của A. tumefaciens với dịch treo tế bào trần Petunia hybrida với sự có mặt của PLO, kết quả tạo ra một tập đoàn tế bào trần có biểu hiện tính chất có vị đắng của đỉnh tăng tr−ởng trong môi tr−ờng có hormone tự do và sự tổng hợp octopine, cả hai đều mJ hoá gen Ti T- DNA (Davey, 1980). Deshayyes (1985) đóng gói PGV23 Neo – một plasmid mang gen aminoglycoside phosphotranspherase type II (APH II; neomycine phosphotranspherase, NTP II)- từ Tn5 có khả năng kháng kanamycine trong tế bào thực vật, vào trong thể tích chất béo và dung hợp với plasmid có chứa túi của tế bào trần thuốc lá sử dụng PEG.
Tiến bộ chính trong chuyển nạp trực tiếp DNA vào tế bào trần đạt đ−ợc khi nó đ−ợc chứng minh rằng trình tự T – DNA là không cần thiết cho sự chuyển nạp ổn định và biểu hiện của DNA lạ trong tế bào thực vật. Một gen ai có thể chọn lọc bao gồm vùng giải mJ của gen Tn5 NPII d−ới sự kiểm soát của gen promoter CaMV VI đ−ợc đ−a vào tế bào trần thuốc lá nh− là một phần của E coli (pABCD1) bằng cách xử lý hỗn hợp tế bào trần – plasmid bằng PEG 6000. Tập đoàn đJ chuyển nạp sẽ đ−ợc chọn lọc trong môi tr−ờng có chứa 7mg/ml kanamycine. Gen lạ sẽ đ−ợc chuyển qua cho thế hệ cây con bằng phép lai Mendel.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 21
Trong khi tế bào trần thuốc lá đ−ợc sử dụng rộng rJi nh− một hệ thống tiêu biểu cho các nghiên cứu DNA thì các hệ thống tế bào trần khác bao gồm lúa cũng đ−ợc quan tâm rộng rJi. Chuyển nạp gen hữu thụ cho Brasica napus đ−ợc chuyển gen bởi pABCD1 vào trong tế bào trần thịt lá bằng ph−ơng pháp xung điện (Guerche,1987). Tính kháng kanamycine đ−ợc truyền qua thế hệ cây con qua con đ−ờng hữu tính bởi lai một tính trạng theo Mendel. Chuyển gen trực tiếp cũng chứng minh khả năng tạo hạt rau Vigna aconitifolia kháng kanamycine mô sẹo tái tạo từ tế bào trần sốc nhiệt xử lý bởi PEG và pLGV Neo 2103 (Kuhler, 1987). Các nghiên cứu chuyển gen trực tiếp vào tế bào trần thực vật cũng cung cấp một hệ thống để quan sát sự biểu hiện gen tạm thời nh− vậy có ích trong việc đánh giá cấu trúc và gen khởi động khi gen reporter sẵn sàng có thể thử nghiệm ví dụ nh− CAT và b-glucurionidase.
Rất hữu ích khi so sánh một vài tính chất chuyển nạp của tế bào trần thực vật và tế bào động vật. Thật vậy, sự thúc đẩy để định l−ợng tính khả thi chuyển DNA trực tiếp vào tế bào thực vật, đặc biệt là tế bào thực vật đJ đ−ợc loại bỏ vách tế bào băng enzym nh− trong tr−ờng hợp tế bào trần thực vật, từ các báo cáo nuôi cấy mô tế bào động vật cho thấy có khả năng chọn và biểu hiện một nhóm gen và hệ gen DNA. Bây giờ cơ hội xuất hiện các thế hệ đột biến do đ−a các đột biến gen vào tế bào trần thực vật t−ơng tác với DNA; đó là các bằng chứng chứng tỏ rằng các mẫu DNA lớn có thể đ−a vào và biểu hiện ở tế bào động vật (Allshire, 1987).
Trọng tâm của mọi thảo luận của các nghiên cứu tế bào trần đến tế bào và sinh học phân tử là các vấn đề của phạm vi nghiên cứu nh− vậy đJ cải thiện kiến thức của chúng ta về phát triển của sinh học thực vật. Nh− chúng ta đJ thấy, tế bào trần có thể cô lập bằng enzym từ một số nhóm tế bào ví dụ nh− tế bào biểu bì lá của cây thuốc lá có thể tái tạo lại thành cây nguyên vẹn (Davey,1974). Lông hút của rễ là sản phẩm tự nhiên của tế bào biểu bì rễ và nó đJ đ−ợc chứng minh khi xử lý bằng enzym có thể làm tiêu huỷ đỉnh sinh tr−ởng của lông hút và phóng thích tế bào trần (Cooking,1985). Tế bào trần cô
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 22
lập từ rễ cây con, thân lá mầm và lá mầm của Lotus corniculatus (sen) sẵn sàng phân chia trong môi tr−ờng nuôi cấy để tạo ra mô sẹo và từ đó có thể sinh ra tế bào trần (Ahuja, 1983). Điều đáng quan tâm là xác định tế bào trần từ lông hút rễ còn giữ tính chất nguyên thuỷ hay không. Xử lý rễ của cây con Lotus corniculatus với cellulase và pectinase phóng thích các tế bào trần của đầu rễ lông hút khi ủ trong môi tr−ờng có enzym khoảng 1 phút thì có khoảng 10% của tế bào trần phân chia để tạo ra một tập đoàn tế bào mà sau đó tạo đ−ợc chồi non. Cây tái tạo có kiểu hình và tế bào bình th−ờng, Các nghiên cứu trong t−ơng lai có thể sẽ làm cho một hệ thống nh− vậy đ−ợc sử dụng để xác định nguồn gốc của tế bào trần có ảnh h−ởng hay không đến con đ−ờng phát triển sau đó.
Trong các tế bào trần cô lập từ dịch nuôi cấy để tái tạo cây nguyên vẹn cho thấy xảy ra qua sự phát sinh phôi dinh d−ỡng (Abdullah,1986). Có thể chăng thay đổi con đ−ờng phát triển này bằng kĩ thuật điện cao thế trong quá trình phân bào của dẫn xuất tế bào trần thực vật nh− đJ quan sát bởi (Rech, 1987). Gần đây, Chand (1988) quan sát thấy sự bóc trần tế bào cây d−ợc liệu thân gỗ Solanum duncamara ở điện áp 250 – 1250 V/cm2, trong ba xung điện kế tiếp nhau, mỗi xung điện kéo dai 10 – 50 ms đJ kích thích sự tăng tr−ởng của mô dẫn xuất từ tế bào trần và cho thấy có gia tăng khả năng biệt hoá (Chand, 1988).
Có lẽ vấn đề phải quan tâm chính là sự t−ơng tác mới lạ giữa các đại phân tử, virus, vi sinh vật và màng tế bào của tế bào trần. Điện xung để hình thành các lỗ trên màng tế bào có thể đ−ợc dùng để khảo sát theo h−ớng này. Hơn nữa điều chủ yếu không phải là tất cả vách tế bào phải đ−ợc bỏ đi, một lợi ích của nghiên cứu trên nhiều mảng. Gần đây chúng ta đJ quan sát cấu trúc nốt sần tạo ra ở rễ lúa, rễ cây con của cây cải cho dầu khi xử lý rễ với hỗn hợp enzym cenlulase và pectinase và cho nhiễm Rhizobium hay Bradyrhizobium (Al – Mallah, 1989 và 1990). Các nghiên cứu này cho bao gồm sự phân huỷ một phần vách tế bào làm lộ ra một phần màng sinh chất của tế bào biểu mô có ý nghĩa quan trọng cho việc nghiên cứu sự cộng sinh của Rhizobium đối với các cây trồng không phải họ đậu (Cooking và Davey, 1991)
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 23