3.2.1.1 Thớ nghiệm: Xỏc ủịnh nồng ủộ enzym tối ưu (cellulose/macerozym)
cho cỏc dũng khoai tõy nhị bội.
Sử dụng dung dịch enzym của moller và cỏc dung dịch khỏc ủể xỏc ủịnh enzym thớch hợp cho dũng nhị bội.
Dung dịch I: Dung dịch ezym của moller cú M/C=0.2g/0.8g/100ml. Dung dịch II: Nền dung dịch I nhưng cú M/C=0.1/0.6/100ml.
Dung dịch III: Nền dung dịch I nhưng cú M/C=0.1g/0.8g/100ml.
3.2.1.2 Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch protoplast.
3.2.1.3 Thớ nghiệm 3: Ảnh hưởng của phương phỏp khủ trựng mụi trường ủến khả năng phõn chia của protoplast.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 31
CT1: Khử trựng mụi trường nuụi bằng nhiệt ủộ (hấp paster): 1210C trong 20 phỳt.
CT2: Khử trựng bằng màng lọc vụ trựng (khụng hấp).
3.2.1.4 Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu ảnh hưởng của cỏc mụi trường nuụi cấy khỏc nhau tới thời gian phõn chia.
Protoplast sau khi tỏch ủược nuụi trờn cỏc loại mụi trường lỏng sau: SKM, VKM, KM8P, 24a, 24b.
3.2.1.5 Thớ nghiệm5: Nghiờn cứu ảnh hưởng cỏc mụi trường rắn tới sự hỡnh thành microcallus. thành microcallus.
Cỏc tế bào ủó phõn chia sau 4 tuần ủược chuyển sang cỏc mụi trường tạo microcallus (OX1, OX2, OX3, OX4, OX5)
3.2.1.6. Thớ nghiệm 6: Nghiờn cứu ảnh hưởng thời gian chuyển sang mụi trường tạo microcallus tới sự hỡnh thành microcallus.
Trờn nền mụi trường thớch hợp nhất cho sự hỡnh thành microcallus ta tiến hành thớ nghiệm về thời gian chuyển. Cỏc dũng protoplast sau phõn chia 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần sẽ ủược chuyển sang mụi trường tạo microcallus.
3.2.2 Bước ủầu xõy dựng quy trỡnh dung hợp protoplast bằng hoỏ chất
PEG.
3.2.2.1 Thớ nghiệm 1: Nghiờn cứu ảnh hưởng của nồng ủộ PEG khỏc nhau tới hiệu suất dung hợp. hiệu suất dung hợp.
Tiến hành dung hợp bằng PEG ở cỏc nồng ủộ 22.5%, 25%, 30%, 40%.
3.2.2.2 Thớ nghiệm 2: Nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian ủ PEG tới hiệu quả dung hợp.
CT1: 24àl PeG + 3 phỳt CT2: 24àl PeG + 5 phỳt CT3: 24àl PeG + 10 phỳt
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 32
3.2.2.3 Thớ nghiệm: Nghiờn cứu ảnh hưởng của mật ủộ protoplast tới hiệu suất dung hợp bằng PEG.
CT1: 2.106 tế bào/1ml CT2: 2,5.106 tế bào/1ml CT3: 2,75.106 tế bào/1ml CT4: 3.106 tế bào/1ml
3.2.2.4 Thớ nghiệm 4: Nghiờn cứu ảnh hưởng của cỏc phương phỏp rửa PEG khỏc nhau ủến chất lượng protopast sau dung hợp. khỏc nhau ủến chất lượng protopast sau dung hợp.
Sau khi ủ PeG ta tiến hành rửa PeG bằng cỏch sau:
CT1 : Lần 1 rửa bằng dung dịch rửa Ca2, lần 2 rửa bằng mụi trường nuụi. CT2 : Lần 1 rửa 2 lần bằng dung dịch rửa Ca2, lần 2 rửa bằng mụi trường nuụi.
CT3 : Lần 1 rửa 1 lần bằng dung dịch rửa Ca2, lần 2 rửa bằng mụi trường nuụi.
CT3 : Lần 1 rửa 2 lần bằng dung dịch rửa Ca2, lần 2 rửa bằng mụi trường nuụi.
3.2.2.5 Thớ nghiệm5: Ảnh hưuởng nồng ủộ Ca2+ ủến sự tỏi tạo thành tế bào và sự phõn chia protoplast.
Chỳng tụi tiến hành bổ sung Ca(NO3)2 ở cỏc nồng ủộ: 1000mg/1, 1500mg và 2000mg/1
3.3. Phương phỏp nghiờn cứu
3.3.1. Tạo vật liệu in vitro
Cỏc dũng khoai tõy diploid ủược ủưa vào nuụi cấy in vitro ủể tạo nguyờn liệu tỏch tế bào trần. Mụi trường nuụi cấy là mụi trường MS cú bổ sung thờm chất khỏng ethylen ủể tăng chỉ số diện tớch lỏ phự hợp cho quỏ trỡnh tỏch protoplast + 25g/l ủường saccarose + 6,5g/l agar, pH: 5,7.
Cõy in vitro ủược ủặt trong phũng nuụi theo chế ủộ nhiệt ủộ là 220C, cường ủộ chiếu sỏng là 3000-4000 lux, quang chu kỳ là 16h chiếu sỏng/ngày.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 33
3.3.2. Tỏch tế bào trần.
Cú thể minh họa quy trỡnh tỏch tế bào trần theo sơ ủồ sau.
Dũng khoai tõy A15 Sau 3- 4 tuần nuụi cấy in vitro.
1-2g lỏ cắt nhỏ,
ngõm trong dung dịch rửa II - 20 phỳt.
Ủ trong dung dịch enzym 12 - 16h.
Dung dịch ủ lọc qua hệ thống rõy lọc 2 lớp.Bổ sung 5ml dung dịch trỏng
Tiến hành ly tõm ở 200-300rmp trong 15' . Protoplast nổi lờn, hỡnh thành lớp băng màu
xanh ủậm.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 34
2ml dung dịch nổi + 5ml dung dịch rửa I, ly tõm ở 300-400rmp trong 5' - Protoplast lắng
xuống.
Hỳt phần lắng + 1ml mụi trường. Nuụi cấy trờn ủĩa.
Cỏc lỏ non của khoai tõy diploid in vitro 3-4 tuần tuổi ủược sử dụng làm nguyờn liệu tỏch tế bào trần. Quy trỡnh tỏch tế bào trần tiến hành theo Mollers (1990) cú cải tiến và sử dụng thờm cỏc mụi trường khỏc, cụ thể gồm cỏc bước như sau:
+ Cắt nhỏ 1-2g lỏ khoai tõy trong ủĩa petri vụ trựng (Φ 9cm) với 10ml dung dịch gõy co nguyờn sinh (dung dịch rửa II-phụ lục 2).
+ Sau khi ủ 15-20 phỳt trong dung dịch gõy co nguyờn sinh, dựng pipet hỳt bỏ dung dịch ra (chỳ ý khụng hỳt theo mẩu lỏ cắt).
+ Tiếp tục ủưa vào ủĩa petri dung dịch enzym (phụ lục 2) với liều lượng 15-20ml/1g lỏ. Quỏ trỡnh ủ enzym kộo dài từ 12-16h.
+ Trước khi tỏch tế bào trần, ủĩa petri ủược lắc nhẹ. Quỏ trỡnh tỏch tế bào trần ủược tiến hành qua hệ thống rõy lọc 2 lớp 30àm và 50àm. Bổ sung 5ml dung dịch trỏng (phụ lục 2) ủể trỏng. Toàn bộ dung dịch ủược chia vào cỏc ống ly tõm và tiến hành ly tõm ở tốc ủộ 200-300 vũng/phỳt, trong vũng 15 phỳt. Sau ly tõm, cỏc tế bào trần sẽ nổi lờn trờn hỡnh thành một lớp băng cú màu xanh ủậm trờn bề mặt ống ly tõm.
+ Dựng micropipet hỳt nhẹ nhàng lớp tế bào trần này (2ml) cho vào ống ly tõm, bổ sung thờm 5ml dung dịch rửa I (phụ lục 2), tiếp tục ly tõm
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 35
ở 300-400 vũng/phỳt trong 5 phỳt. Sau ly tõm, tế bào trần sẽ lắng xuống ủỏy, dựng micropipet hỳt bỏ dung dịch phớa trờn, bổ sung thờm 3ml dung dịch rửa I (phụ lục 2) rồi tiếp tục ly tõm, lặp lại 2-3 lần. Nồng ủộ tế bào trần ủược xỏc ủịnh trờn buồng ủếm dưới kinh hiển vi.
Số protoplast thu ủược trờn 1ml mụi trường (X) ủược tớnh bằng cụng thức sau:
X = a x 25 x 5 x 104 x 1/k Trong ủú: a = là số tế bào trung bỡnh cú trong một ụ. k = là ủộ pha loóng.
3.3.3.Dung hợp tế bào trần
Dung hợp protoplast bằng ủĩa petri thuỷ tinh và ủĩa petri nhựa. Trộn lẫn protoplast của hai dũng khoai tõy nhị bội theo tỷ lệ 1:1, sau 15 phỳt cỏc protoplast kết lắng, nhỏ PEG vào. Ủ trong PEG 1-10 phỳt. Loại bỏ PEG bằng dung dịch Ca2+, sau ủú rửa lại bằng mụi trường nuụi. Với mỗi ủĩa dung hợp bố trớ 3 lần lặp lại.
3.3.4. Cỏc chỉ tiờu theo dừi
- Số lượng protoplast.
- Thời gian bắt ủầu phõn chia tế bào. - Sự kết gắn tế bào sau dung hợp. - Chất lượng tế bào sau khi dung hợp. - Thời gian và khả năng tạo microcallus. - Số lượng và thời gian tạo marcocallus.
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 36
PHẦN IV
KẾT QUẢ NGHIấN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1 Thớ nghiệm 1: Xỏc ủịnh nồng ủộ enzym tối ưu (C/M) cho cỏc dũng
khoai tõy nhị bội.
Mỗi dũng khoai tõy khỏc nhau sẽ cú ủặc ủiểm khỏc nhau về ủộ dầy của thành tế bào, ủộ dày của mụ lỏ. Chớnh vỡ vậy mỗi dũng khoai tõy sẽ cú một enzym phự hợp ủể phõn huỷ thành tế bào và giải phúng protoplasst mà khụng ảnh hưởng tới màng nguyờn sinh chất tế bào.
Do ủú chỳng tụi tiến hành tỏch protoplast theo phương phỏp của Moller và cú một số cải tiến nhất ủịnh ủể phự hợp với từng dũng nhị bội nghiờn cứu. Phương phỏp dựng enzym ủể tỏch protoplast ủược sử dụng rộng rói và phổ biến hơn phương phỏp dựng hoỏ chất. Cỏc nghiờn cứu cho thấy hàm lượng C/M cú ảnh hưởng rất lớn ủến hiệu suất tỏch và chất lượng protoplast. Trong thớ nghiệm này, chỳng tụi tiến hành trờn cơ sở thay ủổi tỷ lệ M/C ủể tỡm ra tỷ lệ enzym thớch hợp cho từng dũng nhị bội nhằm tỏch ủược mật ủộ protoplast (P/ml) llà cao nhất. Kết quả như sau:
Bảng 1: Ảnh hưuởng của dung dịch enzym khỏc nhau ủến khả năng tỏch protoplast. Enzym Dũng Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) A15 16,67x105 10,83x105 26,67x105 A56 30,83x105 18,33x105 9,17x105 B186 26,67x105 5,83x105 18,33x105 A16 20,18x105 16,86x105 28,24x105 H34 31,83x105 13,56x105 19,76x105 H195 12,86x105 36,67x105 26,67x105 B208 32,67X105 5,83x105 18,33x105 A41 30,18x105 16,54x105 12,34x105 P/ml số protoplast/ml dung dịch tỏch
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 37
Hỡnh 1: Ảnh hưởng của dung dịch enzym khỏc nhau ủến hiệu quả tỏch protoplast ở dũng A16
Hỡnh 2: Ảnh hưởng của dung dịch enzym khỏc nhau ủến hiệu quả tỏch
protoplast ở dũng B208 E1 E2 E2 E1 E3 E3
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 38
Sự thay ủổi tỷ lệ M/C cú ảnh hưởng rừ rệt ủến khả năng tỏch protoplast và ngay trong việc sử dụng cựng một loại dung dịch enzmy ủể tỏch cho từng dũng khoai tõy khỏc nhau thỡ cũng thu ủược số lượng protoplast là khỏc nhau. Số protoplast tỏch ủược dao ủộng dũng khoảng 5,83x105P/ml của dũng B186 với dung dịch enzym II ủến ủạt số lượng lớn nhất là 36.67x105P/ml của dũng H195 với dung dịch enzym II. Dung dịch emzym I cho hiệu quả tỏch ủạt cao nhất với những dũng A56 là 30.83x105, H34 là 31,26 x 105, B208 32.67x105 và B186 là 26.67x105.
Như vậy chỳng ta cú thể kết luận rằng dung dịch enzym I tỏch phự hợp với nhiều giống nhất.
- Dung dịch enzym I cú tỷ lệ M/C=0.2g/0.8g/100ml là tối ưu cho tỏch protoplast của dũng A56, H34, B208, B186 ủạt tỷ lệ cao nhất.
- Dung dịch enzym II cú tỷ lệ M/C=0.1g/0.6g/100ml phự hợp tỏch cho dũng H195 ủạt tỷ lệ cao nhất là 36,67x105P/ml.
- Dung dịch enzym III cú tỷ lệ M/C=0.1g/0.8g/100ml là tối ưu cho việc tỏch protoplast của dũng A15, với tỷ lệ 26.67x105P/ml và dũng A1628.24x105P/ml.
4.2. Thớ nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu suất tỏch protoplast. protoplast.
Việc phải tỡm ra dung dịch enzym phự hợp cho việc tỏch potoplast của từng giống ủể ủạt hiệu suất cao nhất quả là quan trọng. Song bờn cạnh ủú thỡ việc tỡm ra ủược thời gian ủ enzym thớch hợp cho từng giống cũng quan trọng khụng kộm. Bởi lẽ thời gian ủ enzym ảnh hưởng khụng nhỏ ủến hiệu suất tỏch protoplast. Sự hoạt ủộng của mỗi enzym với mỗi giống cần 1 thời gian ủ nhất ủịnh, nếu thời gian ủ khụng ủủ nõu thỡ số lượng protoplast thu ủược khi tỏch sẽ thấp. Từ ủú dẫn tới hiệu suất tỏch sẽ thấp, cũn nếu thời gian ủ quỏ lõu sẽ gõy ngộ ủộc cho tế bào dẫn tới tế bào bị vỡ nhiều do ủú hiệu suất tỏch cũng sẽ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 39
thấp (do macerozym rất ủộc cho tế bào). Chớnh vỡ vậy mà chỳng tụi ủó tiến hành thớ nghiệm nghiờn cứu ảnh hưởng của thời gian ủ enzym cho từng giống.
Bảng 2: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch Proptoplast dũng A15 Enzym Thời gian Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h 9.17x105 6.67x105 10.83x105 14h 10.83x105 6.67x105 24.17x105 15h 12.5x105 8.33x105 26.67x105 16h 6.67x105 5.83x105 18.33x105 Sau 13h ủ Sau 14h ủ Sau 15h ủ Sau 16h ủ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 40
Kết quả Bảng 2 cho ta thấy ảnh hưởng rừ rệt của thời gian ủ enzym ủến hiệu quả tỏch protoplast dũng A15. Trong bốn khoảng thời gian tiến hành theo dừi (13h, 14h, 15h, 16h), thỡ tỷ lệ protoplast dao ủộng trong khoảng từ 5.83x105P/ml - với dung dịch enzym II ở thời gian ủ 16h - ủến 26.67x105P/ml - Với dung dịch enzym II và 15h ủ. Khi ủ 15h với dung dịch enzym III cú tỷ lệ protoplast tỏch ủược là cao nhất 26.67x105P/ml, protoplast trũn ủều và ủẹp. Với 16h ủ thỡ protoplast thu ủược bị vỡ nhiều. Nhưng với từng thời gian ủ khỏc nhau thỡ cũng với dung dịch enzym ủú ta thu ủược tỷ lệ protoplast khỏc nhau: Sau 13h cú 10.83x105P/ml, sau 14h là 24.17x155P/ml, sau 15h ủ ủạt 26.67x105P/ml và sau 16h ta cú 18.33x105P/ml. Như vậy ta ủó xỏc ủịnh ủược dung dịch enzym III với 15h ủ là tối ưu cho việc tỏch protoplast.
Bảng 3: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến khả năng tỏch Proptoplast dũng A186
Enzym Thời gian
Dung dịch I
(P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h 10.33x105 6.67x105 9.17x105 14h 17.5x105 10.83x105 10.0x105 15h 26.67x105 12.5x105 15.83x105 16h 18.33x105 7.5x105 9.17x105 Sau 13h ủ sau 14h ủ
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 41
Sau 15h ủ sau 16h ủ
Hỡnh 4. Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến hiệu suất tỏch protoplast dũng khoai tõy B186 (protoplast ngay sau khi tỏch, soi ở vật khớnh 40).
ðối với dũng B186 chỳng tụi cũng tiến hành thớ nghiệm với cỏc mức thời gian ủ là 13h, 14h, 15h, 16h và thu ủược kết quả. Với cựng dung dịch enzym I nhưng với thời gian ủ khỏc nhau thỡ tỷ lệ Protoplast thu ủược cũng khỏc nhau ở 13h nồng ủộ protoplast ủạt 10,33x105, ở thời gian ủ là 14h thỡ tỷ lệ protoplast ủạt là 17,5x105, ở thời gian ủ 15h tỷ lệ protoplast ủạt 26,67x105 và ở 16h thỡ tỷ lệ protoplast là 18,33x105. Cũn với dung dịch enzym II và III là 2 enzym khụng thớch hợp cho việc tỏch thỡ tỷ lệ protoplast thu ủược thấp hơn dao ủộng trong khoảng 6,67x105 ủến 15,83x105. Như vậy chỳng tụi ủưa ra nhận xột với giống B186 ở thời gian ủ 15h với dung dịch enzym I cho tỷ lệ protoplas ủạt ủược là cao nhất.
Bảng 4: Ảnh hưởng của thời gian ủ enzym ủến khả năng tỏch Proptoplast dũng H195 Enzym Thời gian Dung dịch I (P/ml) Dung dịch II (P/ml) Dung dịch III (P/ml) 13h 10.83x105 12.50x105 9.5x105 14h 9.21x105 36.67x105 8.68x105 15h 17.6x105 23.33x105 10,83x105 16h 18.33x105 10.0x105 9.17x105
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 42
Qua số liệu bảng chung ta thấy với dung dịch enzym II thì thời gian ủ ở 14h cho hiệu suất tách protoplast là cao nhất đạt 36,67x105p/ml còn ở thời gian ủ 16h thì hiệu suất tách protoplast thấp nhất chỉ đạt 10,0x105p/ml do thời gian ủ quá lâu nên các TB bị ngộ độc và chết nhiều nên mật độ protoplast là thấp nhất.
Còn với dung dịch enzym I và enzym II là dung dịch không thích hợp cho việc tách. Thì với dung dịch enzym I mật độ protoplast biến động từ 9,21x105 đến 18,33x105. Và với dung dịch enzym I mật độ protoplast biến động từ 8,68x105 đến 10,83x105
Nh− vậy qua số liệu bảng 2 chúng tôi nhận xét với giống H195. ở thời gian ủ 14h với dung dịch enzym II là thích hợp nhất cho việc tách protoplast.
13h 14h
15h 16h
Hình 5. ảnh h−ởng của thời gian ủ enzym đến khả năng tách protoplast dòng khoai tây H195
Trường ðại học Nụng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học nụng nghiệp……… 43
Qua số liệu bảng chỳng ta thấy với dung dịch enzym II thỡ thời gian ủ ở 14h cho hiệu suất tỏch protoplast là cao nhất ủạt 36,67x105p/ml cũn ở thời gian ủ 16h thỡ hiệu suất tỏch protoplast thấp nhất chỉ ủạt 10,0x105p/ml do thời gian ủ quỏ lõu nờn cỏc TB bị ngộ ủộc và chết nhiều nờn mật ủộ protoplas là thấp nhất.
Cũn với dung dịch enzym I và enzym II là dung dịch khụng thớch hợp